腺相關(guān)病毒載體大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)的建立及其機(jī)制研究.pdf

1、腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是一種非致病性基因治療病毒載體。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)80％的人群感染過(guò)AAV病毒而至今尚未發(fā)現(xiàn)任何跟AAV相關(guān)的疾病。重組AAV載體(rAAV)刪除了全部病毒基因組，只保留了兩端具有調(diào)控作用的反向末端重復(fù)序列(InvertedTerminalRepeats，ITR)，因而使其具有更好的安全性。另外，AAV屬于細(xì)小病毒科，其病毒顆粒非常小，物理性質(zhì)穩(wěn)定，容易存儲(chǔ)而不易失活，因而具

2、備生物制品成藥的優(yōu)勢(shì)特征。AAV病毒載體在在許多疾病的治療中都展現(xiàn)出了很好的效果，2009年Science評(píng)選的“十大科技進(jìn)展”中就有AAV在治療黑朦癥上獲得的巨大成功。NewEnglJMed報(bào)道用AAV治療先天性失明的黑朦癥患者，治療者即恢復(fù)了視覺(jué)，可像正常人一樣做體育運(yùn)動(dòng)，且在后期臨床追蹤中未有任何嚴(yán)重不良反應(yīng)。Nature、NatMed等雜志也多次報(bào)道用AAV表達(dá)抗體治療HIV，可完全消除小鼠和猴子體內(nèi)的HIV病毒。除此之外，AA

3、V在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝疾病以及腫瘤等應(yīng)用中都有著較好的表現(xiàn)。因而，AAV作為疾病治療的運(yùn)輸載體越來(lái)越受到全世界的廣泛關(guān)注。
　　 全世界當(dāng)前利用AAV正在進(jìn)行39項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中28項(xiàng)在美國(guó)，7項(xiàng)在歐洲，2項(xiàng)在中東地區(qū)，印度和非洲各有1項(xiàng)。而在南美洲、澳洲以及其他科技發(fā)達(dá)地區(qū)如加拿大、新加坡、日本等許多地方都還沒(méi)有開(kāi)展相關(guān)的臨床試驗(yàn)。限制AAV在其他地區(qū)開(kāi)展臨床試驗(yàn)的一個(gè)非常重要的因素就是AAV病毒包裝難度較大，尤其是受限于大規(guī)

4、模生產(chǎn)，使得AAV在大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)上的應(yīng)用一直難以開(kāi)展，即便是在美國(guó)也還沒(méi)有關(guān)于AAV大規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方案。因而，建立AAV大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)對(duì)于加速AAV載體的應(yīng)用研究和占據(jù)相關(guān)領(lǐng)域研究的制高點(diǎn)具有非常重要的意義。傳統(tǒng)AAV生產(chǎn)是用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，如果要生產(chǎn)出1014vg的病毒，就需要反復(fù)轉(zhuǎn)染共達(dá)5000多個(gè)175cm2的Flask培養(yǎng)瓶，這對(duì)于操作技術(shù)以及人力物力上而言都是極大的限制。為此，國(guó)際上一直在尋求能

5、夠大量生產(chǎn)AAV的方式，建立了包括Ad/AAV，HSV/AAV，生產(chǎn)細(xì)胞株以及昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在內(nèi)的多種生產(chǎn)方式。其中，昆蟲細(xì)胞桿-狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(InsectCell-BaculovirusExpressionVectorSystem，IC-BEVS)生產(chǎn)AAV在近些年引起了廣泛的關(guān)注，是一種非常有潛力的生產(chǎn)系統(tǒng)。雖然在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)AAV已經(jīng)廣泛研究，但是昆蟲細(xì)胞中AAV包裝組份的定位和相互作用幾乎一無(wú)所知，這

6、些定位和相互作用是其基因組復(fù)制、外殼組裝和基因組包裝的關(guān)鍵。本研究著重建立基于昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的大規(guī)?？删€性放大的AAV新穎生產(chǎn)和純化技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上首次對(duì)1，2，8，9四種血清型AAV病毒在昆蟲細(xì)胞中的重組過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)化的動(dòng)態(tài)對(duì)比研究。
　　 第一部分：基于IC-BEV系統(tǒng)的腺相關(guān)病毒生產(chǎn)體系的建立
　　 目的：構(gòu)建基于pFBD骨架載體的包裝AAV所需的重組桿狀病毒載體，重組生產(chǎn)1，2，8，9型AAV。

7、
　　 方法：(1)以pFBD載體為骨架，構(gòu)建攜帶有AAV2的Rep基因以及各血清型Cap基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pABP1，2，8或9，在Rep基因及Cap基因的特定位點(diǎn)引入Intron-ph啟動(dòng)子以啟動(dòng)Rep和Cap基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)；(2)以pFBD載體為骨架，構(gòu)建攜帶有AAV2ITR表達(dá)框的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794；(3)將上述pABP1，2，8，9以及pA

8、BVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794總共六個(gè)載體分別與DH10BacTM細(xì)菌轉(zhuǎn)座重組，藍(lán)白斑篩選出相應(yīng)的重組桿狀病毒載體pABPM1，2，8，9以及pABVNM-hCMV-EGFP和pABVNM-hCMV-H794；(4)包裝重組桿狀病毒ABPM1，2，8，9以及ABVNM-hCMV-EGFP和ABVNM-hCMV-H794；(5)重組桿狀病毒ABPM1，2，8，9分別與ABVNM-hCMV-EGFP或ABVNM-

9、hCMV-H794兩兩重組生產(chǎn)rAAV1-hCMV-EGFP或H794，rAAV2-hCMV-EGFP或H794，rAAV8-hCMV-EGFP或H794，rAAV9-hCMV-EGFP或H794；(6)RT-PCR檢測(cè)相應(yīng)的病毒滴度，WesternBlot檢測(cè)Rep和Cap蛋白的表達(dá)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證rAAV的功能。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pABP1，2，8，9以及pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794載體

10、，并通過(guò)轉(zhuǎn)座重組及病毒包裝獲得相應(yīng)的重組桿狀病毒；成功重組出1，2，8，9四型AAV病毒；RT-PCR、WesternBlot以及細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)分別成功測(cè)定了病毒滴度、蛋白表達(dá)和驗(yàn)證了病毒功能。
　　 結(jié)論：成功建立以昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(IC-BEVS)為基礎(chǔ)腺相關(guān)病毒生產(chǎn)體系。
　　 第二部分：腺相關(guān)病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)、純化及鑒定
　　 目的：在已建立基于IC-BEV系統(tǒng)的腺相關(guān)病毒生產(chǎn)體系的基礎(chǔ)上

11、，放大AAV生產(chǎn)規(guī)模，建立相適應(yīng)的可線性放大的大規(guī)模生產(chǎn)和純化技術(shù)，并建立對(duì)應(yīng)的病毒鑒定和評(píng)價(jià)體系。
　　 方法：采用BD公司的500mlFalcon培養(yǎng)瓶在恒溫培養(yǎng)振蕩器中重組生產(chǎn)rAAV1，2，8和9，比較研究多種細(xì)胞裂解方案、緩沖液體系、離子濃度以及層析緩沖液pH值等條件并進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)AKTAPurifier10蛋白純化儀用AVB親和層析柱分離純化rAAV，并通過(guò)RT-PCR測(cè)定滴度、SilverStaining測(cè)定純度

12、、透射電鏡觀察計(jì)算病毒實(shí)心顆粒與空殼顆粒的比例，細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證純化病毒的功能。
　　 結(jié)果：建立了基于IC-BEVs系統(tǒng)的AAV大規(guī)模生產(chǎn)和純化技術(shù)，目前優(yōu)化的條件適合于rAAv1，2和8的分離純化，每100ml培養(yǎng)體系可生產(chǎn)高達(dá)1013VG的病毒，單次生產(chǎn)即可獲得1014VG的產(chǎn)量，相比傳統(tǒng)方式需轉(zhuǎn)染5000個(gè)175cm2瓶子的細(xì)胞大大提高了效率，得到的病毒純度超過(guò)95％，實(shí)心病毒顆粒占85％左右，病毒具有較好的感染能力。

13、>　　 結(jié)論：我們建立基于IC-BEVS的AAV大規(guī)模生產(chǎn)和純化技術(shù)從產(chǎn)量和純度上評(píng)價(jià)都達(dá)到了世界先進(jìn)水平，為AAV產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用AAV開(kāi)展相關(guān)的研究奠定了基礎(chǔ)。9型AAV的純化條件還需進(jìn)一步探索。
　　 第三部分：IC-BEV系統(tǒng)中生產(chǎn)AAV時(shí)的動(dòng)態(tài)機(jī)制研究
　　 目的：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)AAV已經(jīng)得到廣泛深入的研究，但是AAV在昆蟲細(xì)胞中的包裝生產(chǎn)過(guò)程幾乎一無(wú)所知。我們首次系統(tǒng)的比較研究了rAAV1，2，8，9四

14、種血清型AAV病毒在昆蟲細(xì)胞中組裝的動(dòng)態(tài)機(jī)制，為進(jìn)一步深入理解和優(yōu)化基于IC-BEVS的AAV大規(guī)模生產(chǎn)和純化技術(shù)提供線索。
　　 方法：用抗Rep蛋白，抗各型Cap蛋白，抗rAAV1和rAAV2整個(gè)病毒顆粒以及抗桿狀病毒表面糖蛋白gp64的抗體，分別于12，24，48，72和96小時(shí)通過(guò)免疫熒光技術(shù)研究在昆蟲細(xì)胞中組裝AAV病毒時(shí)各組分的動(dòng)態(tài)作用機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)透射電鏡觀察昆蟲細(xì)胞中重組生產(chǎn)AAV病毒時(shí)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

15、　　 結(jié)果：在昆蟲細(xì)胞中Rep蛋白表達(dá)后迅速進(jìn)入核內(nèi)，隨時(shí)間推進(jìn)濃度逐漸提高并呈簇分布，Cap蛋白表達(dá)后的入核速度相比而言要慢些，但最終也進(jìn)入核內(nèi)并與Rep蛋白的分布密切相關(guān)，其中2型和9型Cap與Rep蛋白的相互作用更為明顯。各型AAV在核內(nèi)組裝，組裝部位與桿狀病毒基質(zhì)以及纖維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，組裝的AAV主要分布在核周的環(huán)區(qū)，環(huán)區(qū)也是大量桿狀病毒積聚的地方，免疫熒光顯示Rep和Cap蛋白在此處發(fā)生相互作用。
　　 結(jié)論：Rep

16、蛋白和Cap蛋白于桿狀病毒特有的病毒基質(zhì)外的環(huán)區(qū)組裝成rAAV，Rep蛋白與各型Cap蛋白之間可能存在相互作用，桿狀病毒與纖維結(jié)構(gòu)以及AAV顆粒的分布密切相關(guān)。AAV在Sf9細(xì)胞中的組裝部位似乎不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)道的核仁區(qū)域。Rep、Cap以及AAV和桿狀病毒等在Sf9細(xì)胞中的精細(xì)作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來(lái)確證。
　　 綜上所述，我們成功建立了基于IC-BEVS的多血清型AAV的大規(guī)模生產(chǎn)和純化技術(shù)平臺(tái)，其產(chǎn)量(1013VG