微囊化人降鈣素基因修飾細胞治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究.pdf

1、背景:原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥為一種以骨量減少,骨微結構破壞,導致骨脆性增加,容易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見的一種原發(fā)性骨質(zhì)疏松,該病的致殘率及致死率較高,是嚴重威脅老年人生存質(zhì)量的多發(fā)病,由此產(chǎn)生的醫(yī)療費用成為家庭和社會的沉重負擔。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥其特征是多在絕經(jīng)后5～10年內(nèi)發(fā)病,主要由絕經(jīng)后雌激素減少引起。雌激素水平低下時骨轉(zhuǎn)換速度加快。在骨重建高轉(zhuǎn)換狀態(tài)下,破骨細胞骨吸收形成的陷窩得不到充分的骨形成修復,骨

2、小梁可穿孔、斷裂,不連接的小梁數(shù)增多,是導致絕經(jīng)后骨量大量流失和骨質(zhì)量降低的主要病理機制。絕經(jīng)后骨代謝為高轉(zhuǎn)換型,骨吸收大于骨形成,因而發(fā)生骨量丟失。應用骨吸收抑制劑是合理的用藥選擇。骨吸收抑制劑主要有雌激素類、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽類及降鈣素類等。其中降鈣素主要由哺乳動物甲狀腺旁濾泡細胞(C細胞)分泌的多肽類激素,由32個氨基酸組成。降鈣素對骨的作用是抑制破骨細胞的活性和增生,從而抑制骨吸收,降低骨轉(zhuǎn)換率。因此降鈣素作為抗骨

3、吸收藥物在骨質(zhì)疏松癥臨床治療中得以廣泛應用。盡管降鈣素在治療骨代謝疾病方面效果良好,但是降鈣素與絕經(jīng)后骨量丟失之間的關系,尚存在爭議。降鈣素在體內(nèi)的半衰期短,要達臨床滿意效果,必須長期反復應用。這使很多病人難以堅持。而且此類藥物有一定的抗原性,限制其臨床應用。
　　目的:本研究首先擬觀察去勢大鼠基礎值及其儲備功能的改變;同時了解體內(nèi)甲狀腺C細胞形態(tài)變化特點。為進一步探討降鈣素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用提供試驗依據(jù)。同時,擬微囊

4、技術和轉(zhuǎn)基因技術結合起來,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法建立降鈣素基因高表達成肌細胞株,再將其微囊化,形成微囊化轉(zhuǎn)降鈣素基因修飾細胞。觀察重組人降鈣素對體外骨重建功能細胞的影響。進而將微囊化轉(zhuǎn)基因修飾細胞移植體內(nèi),觀察對去勢大鼠的骨代謝與骨結構的影響。
　　方法:6月齡清潔級健康雌性SD大鼠16只,隨機均分為去卵巢組和假手術組。去勢12周后用鈣負荷-降鈣素興奮試驗分別觀察兩組降鈣素基礎值及其儲備功能的改變。并處死每組大鼠,留取甲狀腺組織,采用

5、免疫組織化學方法顯示降鈣素陽性細胞并對其進行細胞形態(tài)計量學分析。另外,利用脂質(zhì)體介導法將人降鈣素基因(hCT)轉(zhuǎn)染成肌細胞,以G418篩選出陽性克隆并擴大培養(yǎng)。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western Blot和免疫組織化學分析目的基因及其蛋白表達;并用ELISA法檢測上清中分泌的人降鈣素濃度。將轉(zhuǎn)染有hCT cDNA的L6成肌細胞包被在具有免疫隔離作用的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊內(nèi)形成微囊化基因轉(zhuǎn)染細胞。

6、在體外培養(yǎng)的同時,應用原代培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞方法,觀察重組人降鈣素對細胞形態(tài)、功能的影響。而后將微囊化基因轉(zhuǎn)染細胞移植到大鼠的腹腔,連續(xù)測定腰椎骨密度、腰椎和股骨骨生物力學性能和骨代謝生化指標改變,光鏡及電鏡觀察骨組織病理改變并進行形態(tài)計量學分析, ELISA法檢測血清人降鈣素濃度。探討研究植入微囊化的人降鈣素(hCT)cDNA轉(zhuǎn)染細胞對去勢大鼠的治療效果,為臨床應用基因工程細胞治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供新方法。
　　結果:⑴大鼠

7、切除卵巢后12周,骨小梁數(shù)目減少,纖細,相互連接減弱,成功復制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型。去勢大鼠體內(nèi)降鈣素基礎值及其儲備功能均低于對照組;體內(nèi)甲狀腺C細胞數(shù)目劇增。
　?、脐栃灾|(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含人降鈣素表達基因的質(zhì)粒導入成肌細胞,G418加壓篩選。RT-PCR檢測從mRNA的水平證實染后的成肌細胞中有外源性人降鈣素基因的轉(zhuǎn)錄;通過western blot和免疫組化的方法證實轉(zhuǎn)染后的細胞有人降鈣素蛋白表達的同時,ELISA法也可從五株抗

8、性克隆培養(yǎng)上清中檢測到一定水平的hCT,與對照組克隆相比差異有統(tǒng)計學意義。表明轉(zhuǎn)染后的宿主細胞可以將胞質(zhì)中合成的降鈣素分泌至細胞外。
　?、窃隗w外、體內(nèi)檢測到人降鈣素的持續(xù)分泌,說明重組人降鈣素可滲透通過微囊壁,進而發(fā)揮其生理作用。
　?、戎亟M人降鈣素顯著促進體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖、堿性磷酸酶的活性和礦化功能;呈劑量依賴關系。
　?、芍亟M人降鈣素可減少破骨細胞數(shù)和骨吸收陷窩面積;呈劑量依賴性。
　　⑹植入微囊化的

9、人降鈣素轉(zhuǎn)染細胞后,去勢大鼠骨轉(zhuǎn)換率下降,改善骨小梁微結構,腰椎骨量和骨強度明顯改善。對脛骨的松質(zhì)骨量,部分地或有限度地防止骨丟失。
　　結論:⑴去勢后大鼠甲狀腺C細胞的分泌功能失代償也許是骨量降低的原因之一。
　?、莆⒛一痟CT cDNA轉(zhuǎn)染細胞能合成和向囊外分泌人降鈣素。
　　⑶重組人降鈣素對體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖、分化和礦化功能有明顯促進作用;可減少破骨細胞的數(shù)量,抑制其骨吸收功能。
　　⑷微囊化轉(zhuǎn)基因修飾