受體酪氨酸激酶EphA1和PTK7在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)EphA1和PTK7蛋白在14例正常輸卵管上皮、6例漿液性囊腺瘤、51例交界性漿液性卵巢腫瘤和97例卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)水平。分析二者在卵巢漿液性癌中的表達(dá)情況與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為卵巢漿液性癌的早期診斷、進(jìn)展評(píng)估及預(yù)后判斷提供證據(jù)。并采用轉(zhuǎn)染方法研究EphA1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢漿液性癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　細(xì)胞在含10％胎牛血

2、清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2和95％空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
　　2、細(xì)胞免疫化學(xué)
　　將消化后的HO8910和A2780細(xì)胞懸浮液置于事先放有干凈蓋玻片的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70％融合度時(shí)，撈片，冷丙酮固定15～20min。用3％ H2O2水封閉10min，分別滴加EphA1和PTK7一抗(1∶100)，4℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗室溫孵育30min，DAB顯色2min，自來(lái)水終止顯色。蘇木素復(fù)染，

3、封片。
　　3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，待A2780和H08910細(xì)胞達(dá)到40％～50％融合度時(shí)，按Invitrogen公司Lipofectamine2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的空白對(duì)照組記作未轉(zhuǎn)染組(UTG)，加轉(zhuǎn)染試劑和空載質(zhì)粒的記作模擬組(MG)，加轉(zhuǎn)染試劑和EphA1質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組記作轉(zhuǎn)染組(TG)。用100μl DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基分

4、別稀釋2μl轉(zhuǎn)染試劑及2μg空載質(zhì)?；駿phA1質(zhì)粒，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別混勻室溫靜置5min后，二者混合混勻室溫再靜置15min。去掉培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后，換為1800μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，并將混合物加入相應(yīng)的組內(nèi)，其中UTG組再補(bǔ)200μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，搖勻。在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4h后，換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　4、RT-PCR
　　收集轉(zhuǎn)染48h后的

5、細(xì)胞，采取Trizol法提取總RNA，選擇OligdT引物，按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作步驟，半定量反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板擴(kuò)增EphA1和β-actin內(nèi)參。β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)基因庫(kù)mRNA序列（GenBank序列號(hào):NM001101.3）設(shè)計(jì)其上游和下游引物分別為:5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’和5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為4

6、16bp。根據(jù)基因庫(kù)mRNA序列(GenBank序列號(hào):NM005232)設(shè)計(jì)EphA1上游引物和下游引物分別為:5’-ATCTTTGGGCTGCTGCTTGG-3’和5’-GCTTGTCCTCTCGATCCACATC-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為127bp。反應(yīng)條件為94℃3min，30×(98℃10s，55℃10s，72℃60s)，72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝片。
　　5、細(xì)胞增殖檢測(cè)MTT法

7、r>　　轉(zhuǎn)染48h時(shí)，將六孔板中的各組細(xì)胞消化后以100μl約1×104個(gè)細(xì)胞含量的密度種于5個(gè)復(fù)孔中(100μl/孔)，24h時(shí)按凱基MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(KGA311)說(shuō)明書進(jìn)行，加50μl1×MTT于各孔中，培養(yǎng)4h后棄去板中的培養(yǎng)液。加150μl DMSO于各孔中，振蕩使結(jié)晶物充分融解。使用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)并記錄每個(gè)孔的OD值。
　　6、劃痕實(shí)驗(yàn)
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h時(shí)，細(xì)胞融合度

8、達(dá)到60％以上時(shí)用20μl移液槍槍頭在六孔板均勻劃“一”字線。用PBS漂洗2遍后更換未含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，觀察并拍照。采用ImageJ軟件，在圖片上隨機(jī)劃6條直線，測(cè)量出細(xì)胞間相對(duì)距離，評(píng)價(jià)遷移情況。
　　7、免疫組織化學(xué)（Envision法）
　　石蠟切片經(jīng)60℃2h烤片后，脫蠟水化。采用檸檬酸鹽法進(jìn)行抗原修復(fù)，3％H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別加入EphA1(1:100)和PTK7(1:100

9、)置于4℃濕盒中孵育過(guò)夜或p53(1∶200)一抗，37℃1h。加入二抗，室溫放置30min后，DAB顯色，自來(lái)水終止顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。
　　綜合細(xì)胞染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。染色程度標(biāo)準(zhǔn):基本不著色為0分;淡黃色為1分;黃色為2分;棕黃色為3分。陽(yáng)性比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0％為0分;≤10％為1分;10％～50％為2分;50％～80％為3分;＞80％為4分。根據(jù)染色程度和陽(yáng)性比例評(píng)分乘積，＞4分者為陽(yáng)

10、性高表達(dá)，約≤4分者為陰性低表達(dá)。
　　8、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用x2檢驗(yàn)或fisher確切概率法分析EphA1和PTK7蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。Kaplan-meier單因素生存分析其蛋白表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系，篩選預(yù)后相關(guān)因素。采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸法，分析影響漿液性卵巢癌患者整體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

11、采用Sperman相關(guān)性分析探討EphA1和PTK7與p53是否具有相關(guān)性。認(rèn)為P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　EphA1對(duì)A2780和H08910細(xì)胞系生物學(xué)行為影響的研究:EphA1蛋白在A2780中的表達(dá)為弱陽(yáng)性，在HO8910中的表達(dá)為陰性，RT-PCR顯示EphA1mRNA在A2780和H08910均陰性。EphA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)HO8910和A2780各組細(xì)胞的增殖數(shù)量顯示轉(zhuǎn)

12、染組、模擬組、未轉(zhuǎn)染組OD值逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24h劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示HO8910轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對(duì)間距(1348.00±37.20)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(101.83±21.40)和模擬組(707.00±54.71)(P＜0.001)。A2780轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對(duì)間距(1177.00±15.13)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(159.83±42.52)和模擬組(463.00±44.99)(P＜0.001)。
　　EphA1在卵巢

13、漿液性腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)及意義:EphA1蛋白在正常輸卵管上皮組織和漿液性囊腺瘤中陽(yáng)性表達(dá)率均為100％(14/14，6/6)，在卵巢交界性漿液性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為92.15％(47/51)，EphA1蛋白在輸卵管正常上皮、卵巢漿液性囊腺瘤和交界性卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。EphA1在卵巢漿液性癌中陽(yáng)性表達(dá)率為43.30％(42/97)。EphA1在漿液性卵巢癌中低表達(dá)，與正常輸卵管上皮、良性漿液性卵巢腫瘤、交

14、界性漿液性卵巢腫瘤中表達(dá)相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。EphA1在卵巢交界性漿液性腫瘤中的表達(dá)與臨床分期、轉(zhuǎn)移情況（淋巴結(jié)和/或腹膜轉(zhuǎn)移）、發(fā)生部位和年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）。EphA1蛋白在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床分期、WHO分級(jí)和二級(jí)組織學(xué)(MDACC)分級(jí)相關(guān)（P=0.004，P＜0.001，P=0.008），與轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位、腫瘤最大徑和年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）。
　　PTK7蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表

15、達(dá)及意義:PTK7蛋白在卵巢癌細(xì)胞株HO8910及A2780中呈陰性表達(dá)。PTK7蛋白在92.86％(13/14)正常輸卵管上皮、83.33％(5/6)卵巢漿液性囊腺瘤、45.10％(23/51)交界性漿液性卵巢腫瘤和28.87％(28/97)漿液性卵巢癌中陽(yáng)性表達(dá)。正常輸卵管上皮與卵巢漿液性囊腺瘤、卵巢漿液性囊腺瘤與交界性漿液性腫瘤之間的PTK7表達(dá)無(wú)顯著差異(P=0.521，P=0.102)。漿液性卵巢癌與正常輸卵管上皮、卵巢漿液性

16、囊腺瘤以及交界性漿液性腫瘤之間PTK7表達(dá)存在顯著差異(P＜0.001，P=0.012，P=0.048)。PTK7在交界性漿液性卵巢腫瘤中的表達(dá)與臨床分期和轉(zhuǎn)移情況（淋巴結(jié)和/或腹膜轉(zhuǎn)移）有關(guān)(P=0.038，P=0.038)，與發(fā)生部位和年齡無(wú)關(guān)(P=0.088，P=0.896)。PTK7在卵巢漿液癌中的表達(dá)與臨床分期(P=0.034)、WHO分級(jí)(P=0.004)、MDACC病理分級(jí)(P＜0.001)和轉(zhuǎn)移情況(P=0.025）有關(guān)

17、，與發(fā)生部位(P=0.326)、腫瘤直徑(P=0.298)和年齡(P=0.584）無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:
　　EphA1在輸卵管正常上皮、良性及交界性漿液性卵巢腫瘤表達(dá)無(wú)差別，均比漿液性癌中的表達(dá)高。PTK7蛋白在輸卵管正常上皮、良性、交界性、惡性漿液性卵巢腫瘤中的表達(dá)呈逐步下調(diào)趨勢(shì)。EphA1和PTK7蛋白的低表達(dá)均與漿液性卵巢癌較晚臨床分期、高組織分級(jí)、預(yù)后差正相關(guān)，提示二者參與卵巢漿液性癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為卵巢漿液性腫瘤