大劑量維生素C對(duì)急性脊髓損傷軸索的保護(hù)及組織工程技術(shù)引導(dǎo)其再生的研究.pdf

1、脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）可造成患者的終身癱瘓，給患者家屬和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，目前公認(rèn)的治療措施僅限于急性期大劑量的糖皮質(zhì)激素和外科減壓手術(shù)。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為脊髓損傷的治療帶來了希望，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞具有多分化潛能，可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等替代脊髓損傷后缺失的細(xì)胞成分。近年來，干細(xì)胞移植的研究取得了重大進(jìn)展。然而，干細(xì)胞移植存在較多問題，如來源和倫理問題、長時(shí)間的體外擴(kuò)增、潛在的致瘤危險(xiǎn)性等。大劑量糖皮

2、質(zhì)激素治療脊髓損傷方法的出現(xiàn)曾經(jīng)被認(rèn)為是脊髓損傷治療史上的里程碑，但是隨著廣泛的應(yīng)用于臨床，出現(xiàn)了各種各樣的問題，如各種并發(fā)癥(主要為消化道出血)、高額的治療費(fèi)用以及要求嚴(yán)格的治療時(shí)限，這些都限制了其進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用。
　　維生素C是人體必不可缺的物質(zhì)之一，對(duì)于人體的正常新陳代謝起著重要的作用，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，維生素C在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮中重要的作用，尤其是大劑量維生素C對(duì)于神經(jīng)發(fā)育缺陷疾病有很好的治療效果，本實(shí)驗(yàn)著眼

3、于研究大劑量維生素C對(duì)于脊髓損傷修復(fù)的作用。
　　由于脊髓損傷后損傷部位的軸突斷裂，導(dǎo)致神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)功能受損，從而造成損傷節(jié)段以下的感覺運(yùn)動(dòng)與自主神經(jīng)功能喪失。具體表現(xiàn)為斷裂軸突的遠(yuǎn)端變性、消失，軸突近端發(fā)生逆行性退變。脊髓損傷后發(fā)生一系列繼發(fā)性損傷，造成損傷節(jié)段大量的細(xì)胞死亡以及軸突進(jìn)行性變性壞死，而后形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突的再生以及神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而，對(duì)脊髓損傷的深入觀察指出，脊髓損傷后軸突的再生能力并沒有喪失。斷裂的軸突

4、可向損傷區(qū)生長，但不能穿越損傷區(qū)并重新支配原有靶點(diǎn)。因此，如何使再生的軸突通過損傷區(qū)重新支配原有靶點(diǎn)，成為目前研究的重點(diǎn)。本課題組前期研制的神經(jīng)支架材料具有定向的微管結(jié)構(gòu)，一方面可以阻止瘢痕的長入，一方面為再生的軸突提供了定向微管結(jié)構(gòu)，利于再生軸突到達(dá)遠(yuǎn)端目標(biāo)，有利于脊髓損傷的恢復(fù)。
　　骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSC)是一種多能干細(xì)胞，具備向終末組織細(xì)胞分化的能力，在組織工程

5、研究中備受關(guān)注。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)于其他來源的干細(xì)胞，具有來源廣泛，易于實(shí)現(xiàn)自體移植的特點(diǎn)，相對(duì)其他干細(xì)胞而言，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此本研究選用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，復(fù)合新型支架材料修復(fù)脊髓損傷。
　　第一部分大劑量維生素C治療脊髓損傷的研究
　　目的：明確大劑量維生素C對(duì)于脊髓損傷的治療作用。
　　方法：采用ImpactorModelⅠ型打擊儀參照改良Allen’s法制作大鼠背側(cè)ASCI模型

6、，30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：第1組，對(duì)照組給予生理鹽水；第2組，正常劑量維生素C組，自術(shù)后開始給予每天100mg/kg維生素C腹腔注射，持續(xù)4周；第3組，大劑量生素C組，劑量為每天200mg/kg維生素C。在術(shù)后7、14、21、28天，各組動(dòng)物進(jìn)行BBB評(píng)分以及足跡分析實(shí)驗(yàn)。術(shù)后28天處死動(dòng)物，行HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，測(cè)定損傷區(qū)空洞面積。
　　結(jié)果：大劑量維生素C治療組，行為學(xué)評(píng)價(jià)明顯優(yōu)于對(duì)照組，14天時(shí)，BBB評(píng)分，大劑量維

7、生素C治療組明顯高于對(duì)照組（10.50±1.08VS7.10±0.86，P<0.05），大劑量維生素C治療組與正常劑量維生素C治療組之間，以及正常劑量維生素C治療組與對(duì)照組之間無明顯差別（P>0.05）。足跡分析實(shí)驗(yàn)，14天時(shí)步長，大劑量維生素C治療組明顯高于對(duì)照組（11.80±1.32VS10.11±0.95，P<0.05），步寬，大劑量維生素C治療組明顯小于對(duì)照組（4.85±0.46VS5.63±0.38，P<0.05），組織學(xué)觀察

8、，大劑量維生素C治療組空洞面積明顯小于對(duì)照組（2.56±0.21VS4.538±0.29，P<0.01）。
　　第二部分骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
　　目的：培養(yǎng)高純度、具有分化能力的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
　　方法：選用改良全骨髓貼壁培養(yǎng)法，進(jìn)行BMSC向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，進(jìn)行BMSC表面抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
　　結(jié)果：培養(yǎng)出生長穩(wěn)定的BMSC。經(jīng)相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，表現(xiàn)出成骨細(xì)胞及脂

9、肪細(xì)胞的特性。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示為體積均一的細(xì)胞群，CD29、CD90、CD44分別表達(dá)為99.62％、99.75％、99.02％，CD45、CD34分別表達(dá)為2.40％、2.99％。
　　第三部分新型支架材料復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的研究
　　目的：評(píng)價(jià)支架材料復(fù)合BMSC修脊髓損傷的有效性。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)及行為學(xué)測(cè)定等方法，從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方面綜合評(píng)價(jià)支架材料復(fù)合骨髓基質(zhì)干