308nm準(zhǔn)分子激光對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞活力及bFGF表達(dá)與分泌的影響.pdf

1、一、研究背景 白癜風(fēng)是一種由于黑素細(xì)胞(melanocyte，MC)特發(fā)性損害而致色素脫失的獲得性皮膚病，病因不明，治療較困難。 白癜風(fēng)的病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全清楚，主要有自身免疫學(xué)說、黑素細(xì)胞自毀學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說、遺傳學(xué)說等。近年有人提出微環(huán)境學(xué)說，認(rèn)為表皮微環(huán)境變化參與白癜風(fēng)的發(fā)病。體外研究證實(shí)微環(huán)境中最重要的細(xì)胞——角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)對(duì)MC的生K分化有重要作用，KC和MC在表皮

2、內(nèi)互為比鄰，解剖關(guān)系密切，是近幾年研究白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)理以及治療的熱點(diǎn)之一。KC可分泌一些對(duì)MC有重要影響作用的細(xì)胞因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、α-促黑素(α—melanocyte—stimulating hormone，α—MSH)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve

3、growth factor，NGF)、一氧化氮等，它們以旁分泌的方式調(diào)節(jié)MC的形態(tài)和功能；體外實(shí)驗(yàn)已證明KC與MC混合培養(yǎng)能明顯促進(jìn)MC生長(zhǎng)，兩者之間的直接接觸被認(rèn)為在黑素形成的調(diào)控中起著重要的作用；此外，KC外基質(zhì)在MC增殖分化及軸突形成中扮演著重要的角色。KC分泌的上述因子中，bFGF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能刺激黑素合成的KC源性的細(xì)胞因子，也是最重要的MC自然促分裂因子，天然絲裂原，在MC生長(zhǎng)微環(huán)境中有著重要的意義，它能促進(jìn)MC增殖、分

4、化，還可以刺激皮損外的MC及毛囊外毛根鞘無(wú)色素黑素細(xì)胞的遷移。目前白癜風(fēng)的治療大概可以分為外科療法和非外科療法。 外科療法分組織移植和細(xì)胞移植兩種，前者易形成鵝卵石樣外改變或形成疤痕，并可能發(fā)生同形反應(yīng)及感染。細(xì)胞移植需要實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)知識(shí)，花費(fèi)大，不能用于常規(guī)治療。另外，由于一些MC的生長(zhǎng)因子有致癌性以及受皮區(qū)移植后要進(jìn)行紫外線的照射治療，可能具有潛在的致癌危險(xiǎn)。 藥物治療方面主要有激素類藥物、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、

5、人胎盤提取液、地蒽酚、卡泊三醇、補(bǔ)充微量元素、中藥等等。但藥物治療的效果都有不盡如人意的地方，如副作用大，起效慢、療效不顯著等等。 光療應(yīng)用逐漸普遍，能取得比較好的效果，已成為治療白癜風(fēng)公認(rèn)的最有效的方法。它可通過多方面的作用促進(jìn)色素恢復(fù)，因而起效比較快，更容易保持住色素沉著。光療主要包括光化學(xué)治療、311nm窄波中波紫外線(narrow-band ultraviolet B，NB-UVB)及308nm準(zhǔn)分子激光等。其中光化學(xué)治

6、療容易出現(xiàn)不同程度的光毒反應(yīng)或肝腎功能損害，還可能有遠(yuǎn)期的致癌作用。NB-UVB與光化學(xué)治療相比，療效相當(dāng)，光毒性小，治療時(shí)間更短。但由于非選擇性照射皮膚，累積劑量高，也有潛在的致癌作用。 308nm準(zhǔn)分子激光(308nm excimer laser)是近十年開始應(yīng)用于皮膚病的一種新型紫外線，它光譜窄，純度高，穿透力強(qiáng)，紅斑效應(yīng)相對(duì)較小，副作用少，而且避開了DNA的吸收高峰，故不易引起DNA突變，致癌性降低。國(guó)外已有較多的臨床研

7、究證實(shí)它作為白癜風(fēng)治療的一種新手段，具有見效快、療程短、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，尤其適用于受累面積<30％的穩(wěn)定型者，在面頸部及軀干部位的治療中見效尤為明顯。國(guó)內(nèi)近幾年也陸續(xù)見臨床應(yīng)用上的報(bào)道，同樣取得了很好的療效。308nm準(zhǔn)分子激光已成為白癜風(fēng)光療的最佳選擇。 然而，至目前為止，關(guān)于308nm準(zhǔn)分子激光治療白癜風(fēng)作用機(jī)制方面的研究?jī)H有個(gè)案報(bào)道。認(rèn)為該激光治療白癜風(fēng)的機(jī)制為刺激MC的增殖和遷移、增加黑素的合成，誘導(dǎo)T細(xì)胞調(diào)亡，誘導(dǎo)細(xì)

8、胞因子分泌及炎癥介質(zhì)IL-1、TNF-α、白三烯C4釋放等等。這些研究多著眼于免疫學(xué)方面與MC本身，關(guān)于MC生長(zhǎng)微環(huán)境中最重要的成分——KC及其分泌的因子發(fā)生了什么變化尚未有報(bào)道?；谏鲜鏊岬降腒C分泌的bFGF對(duì)MC的重要性，我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)308nm準(zhǔn)分子激光照射后KC細(xì)胞活力及其產(chǎn)生的bFGF的mRNA表達(dá)水平以及分泌水平進(jìn)行研究，并同時(shí)與對(duì)白癜風(fēng)也有肯定療效的NB-UVB進(jìn)行對(duì)比性研究，從而為臨床治療提供理論上的依據(jù)。 二

9、、研究目的 1.探討308nm準(zhǔn)分子激光對(duì)人KC活力的影響； 2.探討308nm準(zhǔn)分子激光照射前后KC bFGF mRNA表達(dá)水平與分泌水平的變化； 3.與311nm窄波中波紫外線進(jìn)行比較，探討兩種光源的差別。 三、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法 1.標(biāo)本來(lái)源：我院外科門診包皮環(huán)切術(shù)的健康包皮，16≤年齡≤30歲，標(biāo)本切取后立即放入含有抗生素(20ug/ml慶大霉素)的PBS中，4℃中保存，當(dāng)天進(jìn)行KC的體外培養(yǎng)

10、。 2.細(xì)胞培養(yǎng)和觀察：將皮膚標(biāo)本修剪后用消化液消化分離得到表皮，制成表皮單細(xì)胞懸液，接種于限制性角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80％滿時(shí)，進(jìn)行消化、傳代。取第2或第3代細(xì)胞分組后予不同劑量的308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB進(jìn)行照射，并設(shè)對(duì)照組不照射。 3.細(xì)胞活力測(cè)定：細(xì)胞傳代接種至96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至融合50％左右，分別予以兩種不同光源不同劑量：100、200、30

11、0、400、500、600mj/cm2進(jìn)行照射，對(duì)照組不照射。24h后用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。 4.bFGF表達(dá)水平、分泌水平的測(cè)定： 1)細(xì)胞傳代進(jìn)行24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞生長(zhǎng)至60～70％進(jìn)行308nm準(zhǔn)分子激光、NB-UVB照射；24h后上清液離心后-80℃保存用于測(cè)定bFGF分泌水平，細(xì)胞用于測(cè)定bFGFmRNA表達(dá)水平。 2)用哺乳動(dòng)物RNA抽提方法，提取各個(gè)劑量組細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定并

12、計(jì)算所提RNA的OD260/OD280，比值，檢驗(yàn)其純度并計(jì)算RNA濃度。RNA水溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其完整性。 3)參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?4)cDNA進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并攝像，所得電泳圖像用凝膠成像分析軟什對(duì)PCR產(chǎn)物電泳圖像進(jìn)行分析。 5)上述細(xì)胞上清液按照商品化的ELISA試劑

13、盒分別檢測(cè)照射組與對(duì)照組bFGF分泌水平。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：細(xì)胞活力、不同照射劑量的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組bFGF表達(dá)水平、分泌水平采用隨機(jī)區(qū)組方差分析(ANOVA)，同一劑量不同光源之間采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果 1. 308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB照射后都表現(xiàn)為：100、200、300、400mj/cm2劑量照射細(xì)胞活力與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變。500 mj/cm2的劑量照射308nm

14、準(zhǔn)分子激光對(duì)細(xì)胞活力沒有影響，而311nm窄波紫外線細(xì)胞活力下降，兩種光源600mj/cm2劑量照射與對(duì)照組相比細(xì)胞活力都下降。 2. 308nm準(zhǔn)分子激光和NB．UVB在100、200、400 mj/cm2劑量照射后bFGFmRNA表達(dá)水平都比對(duì)照組要高，且在照射劑量范圍內(nèi)隨劑量增大而增高。但同一劑量的308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB照射bFGFmRNA表達(dá)沒有差別。 3.308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB 100、

15、200、400 mj/cm2照射后KC bFGF分泌水平都比對(duì)照組要高，且在照射劑量范圍內(nèi)隨劑量增大而增高。兩種光源予100 mj/cm2照射后KC bFGF分泌水平?jīng)]有差別，而予308nm準(zhǔn)分子激光200、400 mj/cm2照射劑量下KC bFGF的分泌水平要比同等劑量NB—UVB照射要高。 五、結(jié)論 1. 100～500 mj/cmz劑量的308 nm準(zhǔn)分子激光照射對(duì)KC的細(xì)胞活力沒有影響，超過500 mj/cm2

16、會(huì)造成KC損傷無(wú)法恢復(fù)，從而影響細(xì)胞活力。KC對(duì)308nm準(zhǔn)分子激光有比較高的耐受性。 2.308nm準(zhǔn)分子激光在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)能促進(jìn)KC表達(dá)、分泌bFGF，且隨照射劑量的增加而增加。表明它能通過促進(jìn)KC表達(dá)、分泌bFGF達(dá)到促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、遷移、黑素合成增多的可能。這可能308nm準(zhǔn)分子激光是治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制之一，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 3.通過與NB-UVB照射后KC活力及bFGF表達(dá)分泌水平的比較，認(rèn)為①