利用毛細管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術鑒定常見血液感染病原菌的研究.pdf

1、背景隨著社會老齡化進程的加快及HIV感染人群的增多,免疫力低下群體的范圍也在不斷擴大。每年有大量的患者死于血液感染[1,2],尤其是因敗血癥導致的新生兒死亡[3]。據(jù)全國醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)的報告顯示,菌血癥的發(fā)病率在醫(yī)院內(nèi)感染中的構(gòu)成比為1.3％,發(fā)病率為48.56/10萬[4]。在美國因血液感染所致的敗血癥是導致病人死亡的十大原因之一[5]。因此,及時診斷感染病原菌并給予抗菌治療,是降低死亡率的重要一步。培養(yǎng)法作為細菌診斷的金標準,耗時長

2、,操作繁瑣,對營養(yǎng)要求高的細菌難以檢出(如肺炎鏈球菌等),而且易受抗生素的影響,常導致某些細菌無法生長。因此探索建立一種快速檢測血液中的微量病原菌的方法成為亟待解決的問題。細菌的核糖體小亞基rRNA是近年來進行細菌分類和鑒定研究的熱點,為病原菌的分子生物學快速檢測提供了理想靶點[6-9]。
　　 20世紀80年代,在傳統(tǒng)平板凝膠電泳(slab gel electrophoresis,SGE)的基礎上發(fā)展了毛細管電泳技術(ca-p

3、illary electrophoresis,CE),用于快速分離生物大分子。Orita等[10]在同期發(fā)展了用于基因分型的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(single strand conformationpolymorphism,SSCP)。后來,Kuypers等[11]將兩項技術相結(jié)合形成了CE-SSCP來進行基因的突變分析。由于該技術具有樣品用量少、靈敏度高、分析能力強、定量性能好等諸多優(yōu)點,在生命科學中已被廣泛應用于基因突變檢測、PC

4、R產(chǎn)物分析、SNP的快速分型以及mRNA定量[12]、抗菌活性分析[13]等。本研究利用通用引物PCR,結(jié)合毛細管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(CE-SSCP)對常見的血液感染病原菌:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌進行了檢測,進而建立了一種快速檢測常見血液感染病原菌的方法。
　　 方法1.經(jīng)查閱文獻,選取常見血液感染病原菌:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮

5、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌為研究對象,通過NCBI查詢其全基因組序列,利用ClustalX1.81軟件進行多重序列比對,查找16SrDNA、23S rDNA基因序列的保守區(qū)域,在此保守區(qū)設計通用引物。2.提取上述病原菌標準菌株的基因組DNA后,分別對16S rRNA基因和16S-23S rRNA間區(qū)進行PCR擴增,然后進行CE-SSCP分析,建立標準菌株的CE-SSCP圖譜并進行機器碼識別。同時對該方法的敏感度進行研究

6、。3.收集臨床菌株進行CE-SSCP分析,所獲得的圖譜與所建立的標準菌株圖譜進行比較驗證。同時將CE-SSCP法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行比較。
　　 結(jié)果1.在16S rDNA和23S rDNA的保守區(qū)域設計的通用引物,能夠一次對所研究的七種病原菌進行擴增,且片段長度與實際相符合,條帶結(jié)果清晰,未見明顯的非特異性擴增條帶和引物二聚體。2.16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)CE-SSCP分析,七種病原菌具有不同的等位片段長度(Cv≤0.0

7、46％)和出峰時間點(Cv≥1.33％):前者重復性由于后者。經(jīng)多次測量計算出其等位片段長度范圍為:金黃色葡萄球菌(317.40-317.61),大腸桿菌(309.83-309.99),銅綠假單胞菌(305.30-305.59),表皮葡萄球菌(316.34-316.63),肺炎克雷伯菌(307.76-307.96),糞腸球菌(327.28-327.57),肺炎鏈球菌(315.86-315.62)。16S-23S rDNA間區(qū)經(jīng)分析后,也

8、呈現(xiàn)不同的CE-SSCP圖譜,其圖譜經(jīng)機器碼識別,可使細菌的差異鑒別更加快捷。3.對七種血液感染病原菌臨床菌株進行檢測,所有細菌都在所建立的等位片段長度范圍之內(nèi)。該法與培養(yǎng)法的符合率為94.8％,敏感度達18 CFU/ml。
　　 結(jié)論1.所設計的通用引物能夠一次對所研究的七種病原菌進行擴增,且條帶結(jié)果清晰,未見明顯的非特異性條帶和引物二聚體。2.16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)CE-SSCP分析,可同時對七種病原菌進行鑒定,