錳超氧化物歧化酶模擬化合物對(duì)SKOV3細(xì)胞抑制作用的體內(nèi)外研究.pdf

1、研究背景:
　　 上皮性卵巢癌是婦科惡性腫瘤中最致命的腫瘤，死亡率位居?jì)D科腫瘤第一位。盡管手術(shù)治療對(duì)早期卵巢癌的療效良好，但絕大多數(shù)患者病情會(huì)出現(xiàn)晚期進(jìn)展。手術(shù)和化學(xué)藥物治療是卵巢癌治療中的兩個(gè)重要手段，由于晚期卵巢癌的根治性手術(shù)不能達(dá)到理想和滿意程度，故化學(xué)藥物治療對(duì)手術(shù)后的治療就顯得更為重要。但由于晚期卵巢癌極易產(chǎn)生對(duì)化學(xué)藥物的耐藥和全身毒副反應(yīng)，應(yīng)用現(xiàn)有的化學(xué)藥物治療仍然有很高的復(fù)發(fā)率和未控率，因此研發(fā)新型的高效低毒的抗腫

2、瘤藥物是目前卵巢癌治療的研究熱點(diǎn)。
　　 目前國(guó)內(nèi)外研究的新型抗腫瘤藥物種類如下:1.以細(xì)胞信號(hào)分子為靶點(diǎn):包括蛋白絡(luò)氨酸激酶抑制劑、各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、細(xì)胞周期調(diào)控劑、蛋白酶體抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑等。2.血管生成抑制劑。3.抗癌細(xì)胞脫落、粘附和基底膜降解:抗轉(zhuǎn)移藥。4.以端粒酶為靶點(diǎn):端粒酶抑制劑。5.針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥:耐藥逆轉(zhuǎn)劑。6.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向成熟分化:分化誘導(dǎo)劑。7.特異性殺傷癌細(xì)胞:

3、（抗體或毒素）導(dǎo)向治療。8.增強(qiáng)放療和化療的療效:放化療增敏劑。9.提高或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。10.針對(duì)癌基因和抑癌基因的基因治療:導(dǎo)入野生型抑癌基因、自殺基因、抗耐藥基因及反義寡核苷酸、腫瘤疫苗、RNA干擾、MicroRNA(])等。11.靶向cox-2途徑: cox-2抑制劑等。12.天然動(dòng)植物藥物:如原花青素、兒茶素等。13.化學(xué)合成的抗腫瘤藥物:通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)模擬靶向腫瘤特異性靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物，如化學(xué)合成的小分子

4、抗腫瘤藥物等。近年來(lái)化學(xué)合成的小分子抗腫瘤藥物成為新型抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)所用化合物即為模擬錳超氧化物歧化酶(MnSOD)結(jié)構(gòu)所設(shè)計(jì)的化合物。
　　 人體正常的新陳代謝都會(huì)產(chǎn)生自由基，但在特殊情況下會(huì)產(chǎn)生大量自由基，這些大量的自由基通過(guò)氧化作用使人體的細(xì)胞和組織受到損傷，包括自由基使酶失活、自由基損害細(xì)胞膜、自由基損傷導(dǎo)致基因突變和癌變，故自由基是許多疾病發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)。超氧化物歧化酶是細(xì)胞內(nèi)重要的酶性自由基清除劑

5、，可催化O-2歧化為H2O2和O2。人體內(nèi)超氧化物歧化酶中最重要的就是錳超氧化物歧化酶(MnSOD)。MnSOD基因的表達(dá)和調(diào)控對(duì)機(jī)體自由基-自由基清除劑的平衡體系至關(guān)重要，是抗氧化系統(tǒng)的最重要的酶之一。
　　 目前，大量研究已證實(shí)MnSOD與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、侵襲及耐藥等多種生物學(xué)行為關(guān)系密切。但MnSOD在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)報(bào)道不一。普遍認(rèn)為，MnSOD在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中活性減弱，但其在卵巢癌細(xì)胞中活性增強(qiáng)。卵巢癌中，高表達(dá)

6、的MnSOD對(duì)腫瘤細(xì)胞有保護(hù)作用，并可促進(jìn)腫瘤分化進(jìn)展，但是，產(chǎn)生對(duì)卵巢癌保護(hù)性MnSOD量的這一氧化還原平衡被打破后，MnSOD表達(dá)進(jìn)一步增高，引起H2O2過(guò)量，反過(guò)來(lái)又會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)MnSOD超過(guò)卵巢癌保護(hù)性表達(dá)量的話，MnSOD反而可能會(huì)抑制卵巢癌發(fā)展。
　　 近年來(lái)運(yùn)用MnSOD化學(xué)模擬物來(lái)替代天然MnSOD成為研究熱點(diǎn)。由于天然MnSOD分子量大、體內(nèi)半衰期短、不易透過(guò)細(xì)胞膜、穩(wěn)定性

7、差等原因，使其藥用價(jià)值受到了極大的限制。為此，生物化學(xué)界的科研人員用化學(xué)手段合成與表征具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的銅、錳、鐵等金屬離子的小分子配合物來(lái)模擬超氧化物歧化酶以克服天然超氧化物歧化酶的缺點(diǎn)，從而使模擬化合物的小分子配合物有運(yùn)用于臨床的可能。蘭州大學(xué)采用水溶性較好的柔性脂肪胺和具有良好生物相容性的鄰香草醛合成了水溶性和脂溶性較好的MnSOD配合物，并已研究證實(shí)其具有較高的活性。該化合物具有水脂兼溶、活性高、穩(wěn)定性好、分子量小、易跨膜、成本低廉

8、、純度高、產(chǎn)率高等特點(diǎn)，可見(jiàn)其很好的克服了天然MnSOD的局限性，從而有運(yùn)用于臨床的潛在可能性。
　　 MnSODm通過(guò)非細(xì)胞毒性作用抑制腫瘤，沒(méi)有化學(xué)藥物的毒副作用，具有高效低毒的特點(diǎn)，使得MnSODm成為有臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。任何藥物運(yùn)用于臨床的前提是其作用機(jī)制必須明確。而目前國(guó)內(nèi)外甚少有MnSODm抗腫瘤作用的研究，而對(duì)其抗腫瘤的機(jī)制更是研究甚少。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，錳超氧化物歧化酶模擬化合物(MnSODm)聯(lián)合慶大霉素

9、治療，可以減低耳毒性，MnSODm與順鉑協(xié)同作用降低順鉑造成的耳毒性，干預(yù)MnSOD表達(dá)，增強(qiáng)順鉑化療作用;而MnSODm對(duì)腫瘤的治療，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)安嫻、范臨蘭等研究了MnSODm對(duì)白血病K562細(xì)胞的增殖抑制作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MnSODm同時(shí)干預(yù)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)，以觀察其抗腫瘤作用。
　　 本課題以人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞及其裸鼠移植瘤為研究對(duì)象，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)移植瘤組織HE染色，電子顯微鏡觀察藥物治療后腫瘤組

10、織的病理學(xué)變化，并借助于稱瘤重及測(cè)量瘤體大小計(jì)算抑瘤率，查血常規(guī)、肝腎功能變化，檢測(cè)藥物毒性反應(yīng);免疫組化法檢測(cè)瘤組織相關(guān)癌基因;體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖與活性，PI單染和倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡，電鏡觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡周期，PCR、蛋白印跡法研究核因子(NFKB)、bax和bcl-2等基因表達(dá)變化，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從而研究MnSODm在體內(nèi)外對(duì)SKOV3細(xì)胞系及其裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用并

11、探討分子機(jī)理，為卵巢癌治療提供新思路，新方法。
　　 第一章MnSODm抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
　　 目的:
　　 觀察MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 方法:
　　 1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm(0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理0h、24h、48h、72h，CCK-8法檢測(cè)MnSODm處理前

12、后細(xì)胞增殖與活性的變化，順鉑對(duì)照組順鉑濃度為10μg/ml。滴加CCK-8試劑后，在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，記錄結(jié)果。細(xì)胞活性率=1-對(duì)照組OD值-治療組OD值/對(duì)照組OD值×100％（對(duì)照組為0μg/ml組）
　　 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm(0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理72h，倒置顯微鏡觀察MnSODm處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.取對(duì)數(shù)生

13、長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm（0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml）處理72h，PI單染法觀察MnSODm處理前后細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm（0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml）處理72h，透射電鏡觀察MnSODm處理前后SKOV3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 5.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm（0

14、μg/ml，10μg/ml，50μg/ml）處理72h，加入Annexin V和PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MnSODm處理前后細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（(x)±s），采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用多重比較LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.與對(duì)照組比較，MnSODm處理后SK

15、OV3細(xì)胞的增殖及活性明顯受到抑制(P＜0.05)，呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。與順鉑相比，MnSODm濃度為10μg/ml時(shí)，其24、48、72h對(duì)細(xì)胞的抑制作用均小于順鉑(P＜0.05)，而MnSODm濃度為50μg/ml時(shí)，其24h對(duì)細(xì)胞的抑制作用小于順鉑(P＜0.05)，但48、72小時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用則強(qiáng)于順鉑（P＜0.05）。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.與對(duì)照組比較，倒置顯微鏡下SKOV3細(xì)胞經(jīng)MnSODm作用72h后，

16、細(xì)胞變圓、皺縮、破裂，呈不規(guī)則形，出現(xiàn)漂浮狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞，存活的細(xì)胞明顯減少。
　　 3.MnSODm作用后，PI染色顯示SKOV3凋亡細(xì)胞明顯增多。
　　 4.MnSODm處理72h后，透射電鏡下SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞膜破損直至消失，核染色質(zhì)高度濃縮、電子密度增高并邊集于核膜下，有的核染色質(zhì)呈半月形，有的出現(xiàn)核固縮和核碎裂，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡變性等明顯的凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。<

17、br>　　 5.MnSODm處理72h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)顯示SKOV3細(xì)胞凋亡率明顯增高，與對(duì)照組比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 MnSODm可抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，MnSODm可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡。
　　 第二章MnSODm抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的可能機(jī)制的研究
　　 目的:

18、>　　 探討MnSODm抑制人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的可能機(jī)理的研究。
　　 方法:
　　 1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm(0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理72h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MnSODm處理前后SKOV3細(xì)胞周期分布的變化。
　　 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm（0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理7

19、2h，熒光發(fā)光法檢測(cè)MnSODm處理前后SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子Caspase-3/7的活性。
　　 3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm(0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理72h，RT-PCR法檢測(cè)MnSODm處理前后SKOV3細(xì)胞中核因子-κ B/p65、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bcl-2、bax mRNA表達(dá)的變化。
　　 4.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不同濃度的MnSODm

20、(0μg/ml，10μg/ml，50μg/ml)處理72h，Western印跡法檢測(cè)MnSODm處理前后SKOV3細(xì)胞中核因子-κ B/p65、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bcl-2、bax蛋白表達(dá)的變化。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用多重比較LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

21、r>　　 1.與對(duì)照組相比，MnSODm處理后，SKOV3細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.不同濃度的MnSODm處理SKOV3細(xì)胞72h后，SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子Caspase-3/7活性無(wú)明顯改變(P＞0.05)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.MnSODm處理后，SKOV3細(xì)胞中核因子-κ B/p65

22、、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而bax mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.MnSODm作用SKOV3細(xì)胞72h后，Western檢測(cè)結(jié)果顯示:SKOV3細(xì)胞中NF-κB/p65蛋白與對(duì)照組(0μg/ml)比較，表達(dá)明顯降低，而其表達(dá)降低相應(yīng)調(diào)控其下游凋亡抑制因子bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，而凋亡促進(jìn)因子bax蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）

23、。
　　 結(jié)論:
　　 MnSODm可能是通過(guò)影響細(xì)胞周期分布，更重要的是通過(guò)核因子-κ B/p56途徑來(lái)調(diào)控凋亡相關(guān)因子bcl-2、bax從而實(shí)現(xiàn)抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡作用的，而其抑制卵巢癌細(xì)胞增殖與Caspase-3/7因子無(wú)關(guān)。
　　 第三章 MnSODm對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠異體移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用
　　 目的:
　　 建立SKOV3裸鼠異體移植瘤模型，觀察陽(yáng)性對(duì)

24、照藥物順鉑和不同劑量的MnSODm對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):將SKOV3細(xì)胞用含10％新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加青霉素和鏈霉素，于37℃、5％CO2混合氣體95％飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3d換液1次。
　　 2.種植瘤體:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后配成2.5×106個(gè)細(xì)胞/ml，取細(xì)胞懸液按每鼠0.2ml接種于荷瘤小鼠背部皮下，腫瘤穩(wěn)定生長(zhǎng)后，選擇腫瘤生長(zhǎng)旺

25、盛且無(wú)破潰的荷瘤小鼠，頸椎脫位處死，切開(kāi)皮膚，剝離腫瘤。
　　 3.異體移植:將瘤組織剪切成1.5mm×1.5mm×1.5mm左右的小塊兒，用套管針接種于SPF級(jí)別BALB/c-nu裸小鼠（4～6周齡，雌性，體重20～22g）背部皮下。用游離標(biāo)尺測(cè)量移植瘤直徑。以皮下結(jié)節(jié)直徑大于0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。
　　 4.分組:裸小鼠移植瘤模型建成后，隨機(jī)分組為:陰性對(duì)照組即生理鹽水對(duì)照組、化療藥陽(yáng)性對(duì)照組即順鉑組、MnSODm高

26、劑量組、MnSODm中劑量組和MnSODm低劑量組，各藥物腹腔注射治療7天。
　　 5.給藥7天后，次日停藥，使用電子天平稱重，將各組裸鼠眼眶取血后處死，使用內(nèi)裝有肝素抗凝劑收集血液，取300μl血液使用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞及血小板數(shù)目，取0.5ml血液靜置30min后，離心取血清，檢測(cè)各組裸鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)，血肌酐(Ccr)的變化。
　　 6.處死裸小鼠后，剝除腫瘤，稱瘤重，測(cè)量瘤體積;

27、計(jì)算腫瘤抑制率（抑制率大于30％為有效）和T/C值，T/C值的計(jì)算方法:T/C=(TRTV/CRTV)×100％其中TRTV為治療組RTV，CRTV為陰性對(duì)照組RTV，RTV=VT/V0，VT為給藥7天后瘤的體積，V0為給藥時(shí)測(cè)量瘤的體積;結(jié)果T/C小于40％為有效。
　　 7.處死裸小鼠后，取各組腫瘤組織用10％甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，HE染色后光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察;并留組織行免疫組織化學(xué)法染色。
　　 8.采用

28、SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（(x)±s），進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組用藥前后比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用多重比較LSD法，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察:在對(duì)瘤體移植后7天內(nèi)的觀察得出

29、，異體移植瘤生長(zhǎng)的一般情況較好，無(wú)樣本丟失;并觀察了分組后各干預(yù)組裸鼠及其移植瘤的表現(xiàn)，得出各治療組均能夠明顯改善裸鼠精神、活動(dòng)度、反應(yīng)，瘤體生長(zhǎng)等一般情況。
　　 2.腫瘤體積的變化:各治療組腫瘤體積與對(duì)照組比較，腫瘤體積明顯縮小(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組治療前后腫瘤體積比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T/C比值結(jié)果:順鉑組T/C比值是36％、MnSODm高劑量組是33％、中劑量組是41％、低劑量組是45％。

30、T/C小于40％為治療有效，。
　　 3.各組移植瘤的腫瘤重量和治療后裸鼠體質(zhì)量的變化:殺死裸鼠后剝?nèi)×鲶w稱瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率，各治療組與對(duì)照組比較，腫瘤重量明顯減低，除MnSODm低劑量組外，其余各治療組與對(duì)照組比較(P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MnSODm高劑量組腫瘤抑制率66.30％，中劑量組腫瘤抑制率54.02％，低劑量組腫瘤抑制率32.98％。腫瘤抑制率＞30％為有效。在處死前對(duì)各組裸鼠進(jìn)行稱重后，發(fā)現(xiàn)各組裸鼠在藥物

31、干預(yù)下體質(zhì)量未發(fā)生明顯改變，各治療組與對(duì)照組比較(P＞0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.組織形態(tài)學(xué)觀察:生理鹽水對(duì)照組表現(xiàn)低分化腺癌特點(diǎn)，腫瘤呈實(shí)性團(tuán)塊兒狀，癌細(xì)胞密集，細(xì)胞有明顯異型性，核大深染，染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀，有明顯核仁，胞漿豐富，可見(jiàn)較多核分裂像，間質(zhì)極少。MnSODm高劑量組HE染色表現(xiàn):細(xì)胞排列較稀疏，可見(jiàn)大片紅染無(wú)結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，瘤細(xì)胞核深染、固縮;MnSODm中劑量組壞死面積較大;MnSODm低劑量組變化不明顯，與

32、生理鹽水組染片相似。順鉑治療組圖片表現(xiàn)與高劑量組相似。
　　 5.對(duì)血細(xì)胞及肝腎功能的影響:使用LSD法統(tǒng)計(jì)后結(jié)果提示，不同劑量的MnSODm治療組與生理鹽水組比較（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;順鉑治療組與生理鹽水組比較(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MnSODm高、中劑量組比較（P＜0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MnSODm低劑量組比較(P＞0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MnSODm各治療組相互比較(P＞0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

33、
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立裸鼠異體移植瘤動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠異體移植瘤奠定基礎(chǔ)。
　　 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠異體移植瘤生長(zhǎng)具有抑制作用，且具有低毒的優(yōu)點(diǎn)。
　　 第四章MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠異體移植瘤作用前后bcl-2、bax表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 采用免疫組織

34、化學(xué)方法檢測(cè)MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤bcl-2及bax蛋白的影響，探討MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用可能機(jī)理的研究
　　 方法:
　　 1.裸鼠移植瘤模型的建立;
　　 2.隨機(jī)分4個(gè)組:陰性對(duì)照組即生理鹽水對(duì)照組、MnSODm高劑量組、MnSODm中劑量組和MnSODm低劑量組，腹腔注射上述藥物治療7天。
　　 3.停藥次日終止觀察，處死裸鼠

35、，將瘤體標(biāo)本應(yīng)用免疫組化(SABC)法對(duì)進(jìn)行組織切片染色，使用bcl-2及bax兩種免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑;
　　 4.完成染片后，使用高清晰數(shù)碼顯微鏡攝片，采集圖片，使用Motic ImagesAdvanced312分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢測(cè)bcl-2及bax蛋白在人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中及MnSODm各劑量組干預(yù)后的強(qiáng)弱表達(dá)結(jié)果。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，

36、計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（(x)±s）。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用多重比較LSD法，P＜0.05為有差異，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.藥物治療后裸鼠腫瘤細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá):陰性對(duì)照組免疫組化結(jié)果提示，人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中， bcl-2蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞漿與核膜處，胞漿或是核膜中著色數(shù)量較多，呈現(xiàn)棕褐色深染，說(shuō)明bcl-2蛋白在人上皮性

37、卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中的表達(dá)水平較高;MnSODm三個(gè)不同梯度給藥組，著色的胞漿范圍逐漸減少，著色深度亦逐漸變淺，說(shuō)明bcl-2蛋白的表達(dá)與梯度呈非直線相關(guān)性。在MnSODm高劑量組中僅見(jiàn)極少數(shù)著色，主要定位于細(xì)胞漿，核膜較少見(jiàn)，說(shuō)明bcl-2蛋白在MnSODm高劑量干預(yù)下以低表達(dá)顯示。
　　 2.藥物治療后裸鼠腫瘤細(xì)胞bax蛋白的表達(dá):bax蛋白表達(dá)，其定位于胞漿;bax在人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤組

38、織中表達(dá)較弱，胞漿中呈現(xiàn)棕色淺染，著色范圍小，說(shuō)明bax蛋白在其中表達(dá)很少，幾乎不表達(dá);MnSODm三個(gè)不同梯度給藥組，胞漿及核膜著色范圍逐漸增大，細(xì)胞漿著色增強(qiáng)，顯示bax蛋白的表達(dá)呈梯度上升的趨勢(shì)。其中MnSODm高劑量組中見(jiàn)染色呈棕黃色，說(shuō)明bcl-2蛋白在MnSODm高劑量干預(yù)下以高表達(dá)呈現(xiàn)。
　　 3.MnSODm各治療組bcl-2、bax表達(dá)與陰性對(duì)照組（生理鹽水組）之間比較（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見(jiàn)MnS

39、ODm不同濃度干預(yù)組均能夠下調(diào)bcl-2的表達(dá)，上調(diào)bax蛋白的表達(dá)。
　　 4.MnSODm高、中、低三個(gè)濃度組bcl-2、bax表達(dá)比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著MnSODm劑量的增加，bcl-2的表達(dá)減弱，bax的表達(dá)增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.bcl-2及bax參與了上皮性卵巢癌SKOV3移植瘤組織細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的過(guò)程;
　　 2.證實(shí)了MnSODm可能通過(guò)上調(diào)bax蛋白，下調(diào)bcl-

40、2蛋白來(lái)抑制人上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠異體移植瘤之生長(zhǎng)。
　　 全文小結(jié):
　　 1.成功建立人上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠異體移植瘤動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究MnSODm對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠異體移植瘤治療奠定了基礎(chǔ)。本模型系二次傳代后，腫瘤在體內(nèi)成長(zhǎng)，成瘤率穩(wěn)定，試驗(yàn)周期短，易于實(shí)施干預(yù)措施，樣本具有均一性和可重復(fù)性，能真實(shí)反映腫瘤在體內(nèi)的演變過(guò)程。
　　 2.觀察荷瘤鼠體重、一般狀況變化，檢

41、測(cè)小鼠用藥物治療前后血白細(xì)胞、血小板、轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮的變化，真實(shí)反映了MnSODm在體內(nèi)毒性低的特點(diǎn)。
　　 3.首次將MnSODm應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn)，為MnSODm有可能應(yīng)用于臨床提供了可靠的臨床前實(shí)驗(yàn)室研究依據(jù)。
　　 4.MnSODm可抑制SKOV3細(xì)胞增殖，呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，MnSODm可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡。
　　 5.MnSODm高劑量組腫瘤抑制率最高，作用于腫瘤細(xì)胞72h的細(xì)胞凋亡率最高

42、，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)MnSODm對(duì)SKOV3的作用呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，但是毒性沒(méi)有相應(yīng)增加。
　　 6.MnSODm作用于體內(nèi)試驗(yàn)，采取腹腔內(nèi)注射，局部皮膚組織沒(méi)有出現(xiàn)破潰、紅、腫、熱、痛等現(xiàn)象，也沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉腹脹等消化道不適癥狀，說(shuō)明該種化合物不僅體內(nèi)代謝造成的毒性反應(yīng)小，直接組織刺激性亦很小，值得進(jìn)一步研發(fā)。
　　 7.MnSODm可能是通過(guò)影響細(xì)胞周期分布，主要將腫瘤細(xì)胞調(diào)控在G0/G1期;更重要的是通過(guò)核因子