Noggin mRNA與BMP4 mRNA在骨折愈合中的表達(dá).pdf

1、目的：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)具有骨誘導(dǎo)活性，在骨折愈合中起重要誘導(dǎo)成骨作用，這一點(diǎn)已得到國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的公認(rèn)。Noggin蛋白是發(fā)育過程中BMPs蛋白的一種拮抗劑，但其在骨愈合中的作用尚不為人所知。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法，探討noggin mRNA與BMP4 mRNA在骨折愈合過程中的表達(dá)及二者的關(guān)系，旨在闡明noggin和BMP4在骨折愈合中的作用，進(jìn)一步揭示骨折愈合的機(jī)制，為骨折的治療提供理論依據(jù)。

2、 方法：1在氯胺酮腹腔注射麻醉下，用定支點(diǎn)折骨法造成BalB/C小鼠左脛腓骨中段閉合性骨折，不用內(nèi)外固定。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于骨折后0d、0.5d、2d、5d，10d和21d在麻醉和無菌操作條件下在冰盒上取骨折端標(biāo)本，取材范圍包括兩骨折端及周圍軟組織。標(biāo)本切除離體后迅速置于液氮內(nèi)降溫至-196℃,然后-70℃超低溫冰箱凍存。2我們以GenBank提供的noggin基因和BMP4基因的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增特異引物。取不同時(shí)

3、間點(diǎn)的骨折部位周圍組織提取總mRNA并逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。以小鼠骨折愈合組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增得到兩條分別約341bp和260bp的cDNA片段。經(jīng)測序證明，這兩個(gè)片段分別為noggin基因和BMP4基因片斷。擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，所得圖像用Fluorchem凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，分析各產(chǎn)物的Integrated Density Value(IDV值)，將BMP4和noggin IDV值與同一樣本β-act

4、in的IDV值相比所得比值代表樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果重復(fù)3次以上。結(jié)果：骨折后12h(0.5d)即能檢測到BMP4 mRNA的表達(dá)，骨折后2d表達(dá)量達(dá)到高峰，約為12h時(shí)的3倍。此后，骨折后5d BMP4表達(dá)量下降，10d時(shí)出現(xiàn)小幅回升，到骨折后21d表達(dá)量再次下降。對(duì)noggin mRNA，骨折后12h即有表達(dá)，骨折后2d時(shí)表達(dá)量同樣達(dá)到高峰，約為12h時(shí)表達(dá)量的5.5倍，是BMP4高峰值的近2倍，此后noggin基因表達(dá)量逐

5、漸下降，至骨折后21d時(shí)，表達(dá)量已經(jīng)接近BMP4的表達(dá)水平。二者表達(dá)水平的總體變化基本相似，有明顯的相關(guān)性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)以RT-PCR法檢測了骨折愈合過程中BMP4 mRNA和noggin mRNA的表達(dá)及兩者的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)BMP4和noggin的表達(dá)具有相似的規(guī)律，由此證明，BMP4和noggin均是骨折修復(fù)過程中的重要基因，noggin在骨折愈合過程中起重要的調(diào)控作用。 意義：本課題揭示了骨折愈合中BMP4作用的負(fù)調(diào)