基于PSCA肽—DNA復(fù)合疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)效應(yīng)的檢測(cè).pdf

1、前列腺癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)中老年男性健康的惡性腫瘤之一。對(duì)于激素抵抗型前列腺癌的治療，目前尚無(wú)有效方法。利用CTL的特異性殺傷作用對(duì)前列腺癌進(jìn)行免疫治療，已顯示出良好的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有疫苗治療的有效率不到30%，有待進(jìn)一步提高。本研究以探索新型高效的前列腺癌治療性CTL疫苗為目標(biāo)，以新近鑒定出的前列腺癌相關(guān)抗原PSCA為靶標(biāo)，依據(jù)陽(yáng)離子肽類(如PLL)“包裝”DNA的特性，將優(yōu)勢(shì)CTL表位肽PSCA14-22與PLL相連，用帶正電荷的抗原肽

2、PLL-PSCA14-22“包裝”帶負(fù)電荷的包含PSCA編碼基因的質(zhì)粒DNA，調(diào)節(jié)正負(fù)電荷比使其形成“病毒樣”顆粒，構(gòu)建PSCA肽-DNA顆粒型疫苗，以期提高疫苗的免疫原性。以HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，檢測(cè)該疫苗的免疫效應(yīng)。預(yù)期的研究結(jié)果為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：設(shè)計(jì)、制備和鑒定PLL-PSCA14-22/pcDNA3.1(+)-PSCA復(fù)合疫苗并檢測(cè)其免疫學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：通過(guò)化學(xué)合成多

3、聚賴氨酸(全序列為N-PLL-ALQPGTALL-C)，將帶正電荷的多聚賴氨酸(PLL)通過(guò)化學(xué)方法與PSCA的一個(gè)CTL表位肽PSCA14-22偶聯(lián)，將上述陽(yáng)離子多肽PLL-PSCA14-22與帶負(fù)電荷的編碼PSCA的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-PSCA利用正負(fù)電荷相吸作用制備靶向PSCA肽-DNA復(fù)合疫苗。
　　 通過(guò)DNA阻滯實(shí)驗(yàn)觀察不同電荷比的復(fù)合疫苗的電泳情況，檢測(cè)帶負(fù)電荷的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-PSCA是否

4、被帶正電荷的PLL-PSCA14-22所包裹；
　　 通過(guò)DNaseⅠ保護(hù)實(shí)驗(yàn)鑒定制備的疫苗，檢測(cè)制備成功的復(fù)合疫苗能否抵擋DNaseⅠ的消化作用；
　　 將制備成功的不同電荷比的復(fù)合疫苗體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)該疫苗的轉(zhuǎn)染效率，確定轉(zhuǎn)染效率最高的復(fù)合疫苗的正負(fù)電荷比；
　　 通過(guò)LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該疫苗對(duì)PSCA陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的特異性殺傷效應(yīng)。
　　 結(jié)果：當(dāng)PLL-P

5、SCA14-22多肽與pcDNA3.1(+)-PSCA重組質(zhì)粒正負(fù)電荷比≥2時(shí)，DNA電泳條帶完全消失，說(shuō)明重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-PSCA完全被PLL-PSCA14-22多肽所包裹；
　　 當(dāng)PLL-PSCA14-22多肽與pcDNA3.1(+)-PSCA重組質(zhì)粒正負(fù)電荷比≥2時(shí)，復(fù)合疫苗可有效抵抗DNaseⅠ的消化作用。
　　 復(fù)合疫苗在體外可有效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，且當(dāng)正負(fù)電荷比為64:1時(shí)出現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)染效率