胚胎大鼠腦源性神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性及液壓沖擊腦損傷大鼠顱內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、　　目的:采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)，體外分離培養(yǎng)胚胎大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCells，NSCs)，并進(jìn)行擴(kuò)增傳代，觀察其自我增殖和多潛能分化特性。方法:1.取材及接種：無(wú)菌條件下取出胚胎14～16天SD大鼠的大腦皮質(zhì)，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA進(jìn)行消化，以吸管吹散至單細(xì)胞狀態(tài)，加入含有EGF和bFGF的NSCs標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，以1×106/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶中，置入37℃、飽和濕度、5％CO2條件下開(kāi)放懸浮培養(yǎng)

2、。培養(yǎng)6～7d后形成的細(xì)胞球，用細(xì)口吸管進(jìn)行機(jī)械分離，將大細(xì)胞球分散成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)傳代培養(yǎng)。每3天以同樣方法傳代一次。2.NSCs增殖能力的檢測(cè)：在原代和第三代培養(yǎng)的NSCs培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)，培養(yǎng)24h，固定后行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。3.NSCs的分化培養(yǎng)：將原代和第三代NSCs接種于預(yù)先涂布鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，加入含有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的NSCs分化培養(yǎng)液，觀察NSCs貼壁后的遷移、增殖

3、和分化。4.免疫細(xì)胞熒光染色法對(duì)NSCs及其多分化潛能的鑒定：分別用抗NSCs特異性骨架蛋白——巢蛋白(nestin)抗體及神經(jīng)元(MAP2)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)的特異性抗體，采用免疫熒光染色法鑒定原代及傳代的神經(jīng)細(xì)胞球中是否含有NSCs及其多向分化能力。結(jié)論:本研究中從胚胎大鼠大腦皮質(zhì)分離出來(lái)的NSCs，具有自我更新和多向分化能力，多次傳代可保持原有特性；EGF和bFGF對(duì)NSCs的存活、增殖具有重要作用；在細(xì)胞貼壁基質(zhì)存在的情