計算機輔助構建組織工程肝臟仿生三維血管網(wǎng)絡的研究.pdf

1、第一部分骨髓源性間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和分化
　　 目的：探討小鼠骨髓源性間充干細胞(mesenchymal stem cells MSCs)體外培養(yǎng)、鑒定、分化的方法，研究間充質干細胞在體外環(huán)境下向內皮細胞分化的效率和功能變化。
　　 方法：分離小鼠股骨、脛骨，肝素抗凝，沖出骨髓，以Percoll密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法聯(lián)合分離、培養(yǎng)、純化骨髓間充質干細胞。我們通過MTT法制備骨髓干細胞體外生長曲線。以CD2

2、9、CD90、CD105、CD34、CD415單克隆抗體通過流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面標志。通過以地塞米松、胰島素等誘導P3代MSC向脂肪細胞分化，誘導后，以油紅染色鑒定分化的脂肪細胞。以VEGF誘導MSC向內皮細胞分化，以CD34、KDR等內皮細胞表面標志鑒定誘導后的內皮細胞。
　　 結果：(1)密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法分離細胞，細胞接種12h后，可見有圓形或橢圓形細胞貼壁，72h后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細胞，細胞培養(yǎng)

3、10天后，出現(xiàn)致密的貼壁細胞層，此時細胞的兩極開始有規(guī)律地排列成束狀。(2)CD29、CD90、CD105流式檢測MSC表面標志，陽性率均在90％以上。CD34、CD415則都低于8％。(3)骨髓干細胞P3向脂肪細胞誘導后，加入油紅O染液顯示細胞內有橙紅色脂肪滴呈現(xiàn)。(4)骨髓干細胞經(jīng)血管內皮因子誘導誘導一周時，有散在的鵝卵石樣細胞出現(xiàn)。誘導兩周后，形成致密的貼壁細胞層，大部分細胞呈圓形或卵形形，細胞呈“鋪路石”樣排列。CD34、KDR

4、陽性率分別為89.24±6.37％，85.19±4.52％。FITC-LIEA-1，DiI-acLDL雙染誘導后內皮細胞陽性率為89.83±4.49％。同時，誘導后的內皮細胞在體外保持良好的成管能力。
　　 結論：密度梯度離心法結合貼壁培養(yǎng)法可以在體外分離、培養(yǎng)出高純度骨髓間充質干細胞。骨髓間充質干細胞在體外經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，依舊具有多向分化潛能。
　　 第二部分可降解Poly(EC-CL)電紡膜的制備和表征
　　

5、 目的：以己內酯和碳酸亞乙酯為原料合成可降解高分子聚合物聚己內酯-碳酸亞乙酯Poly(EC-CL)，通過靜電紡技術制備納米Poly(EC-CL)電紡膜。
　　 方法：以甲苯為溶劑，通過稀土配合物Nd(DBMP)3催化碳酸亞乙酯和CL開環(huán)共聚合。NMR檢測聚合物化學結構，F(xiàn)TIR傅里葉全反射紅外光譜分析聚合物中特征集團的變化。以六氟異丙醇為溶劑，EC/CL共聚物比例為1:9，1:6，1:4的Poly(EC-CL)共聚物為原料，分別

6、制備不同濃度的電紡膜，通過掃描電鏡(SEM)觀察紡絲膜的纖維形貌。力學性能測試檢測各組電紡膜的拉伸強度、楊氏模量和斷裂伸長率。
　　 結果：從共聚物Poly(EC-CL)紅外圖譜證實聚合物為酯類聚合物，通過核磁共振圖譜沒有發(fā)生EC單體的均聚合和脫CO2副反應發(fā)生，所得共聚物為無規(guī)共聚物。在poly(EC-CL)濃度為5％時，當EC/CL從1:9上升到1:4時，纖維直徑從212±52nm上升到522±68nm，poly(EC-CL

7、)濃度為10％時，當EC/CL從1:9上升到1:4時，纖維直徑從535±79nm上升到956±142nm，poly(EC-CL)濃度為15％時，EC/CL為1:9時，電紡膜纖維直徑為867±93nm，而EC/CL濃度為1:6和1:4時，不能形成有效電紡紡絲。力學性能測試發(fā)現(xiàn)隨著EC含量的增高，聚合物拉伸強度、屈服強度和楊氏模量逐漸下降，而斷裂伸長率隨EC含量增高而增大。
　　 結論：Poly(EC-CL)的濃度影響電紡纖維膜的形

8、態(tài)，Poly(EC-CL)是一種力學性能可調控的新型可降解高分子材料。
　　 第三部分Poly(EC-CL)/VEGF電紡膜片的制備及生物學性能檢測
　　 目的：以合成高分子材料Poly(EC-CL)和血管內皮生長因子VEGF為原料，利用靜電紡絲技術構建具有良好細胞相容性和機械性能的納米支架。
　　 方法：將VEGF與Poly(EC-CL)混合，配置成質量比為0ng/g、10ng/g、100ng/g、1ug/g的

9、溶液，電壓15kV，流速2ml/h電紡納米纖維支架。掃描電鏡檢測電紡膜納米形態(tài)，細胞增殖試驗、Live/Dead細胞試劑盒檢測試驗、細胞黏附試驗、LDH釋放試驗、間接接觸溶血試驗、皮下植入試驗檢測電紡膜細胞相容性和血液相容性。Poly(EC-CL)電紡膜誘導分化MSCs試驗檢測電紡膜內VEGF體外分化MSC的能力。
　　 結果：混合VEGF的poly(EC-CL)與純poly(EC-CL)聚合物膜片相比，纖維形態(tài)沒有分別，納米纖

10、維直徑在440±55nm，我們增加VEGF含量，纖維直徑?jīng)]有明顯變化(p>0.05)。細胞增殖試驗、Live/Dead細胞試劑盒檢測試驗、細胞黏附試驗證實Poly(EC-CL)/VEGF電紡膜具有良好的細胞性容性，VEGF/poly(EC-CL)(100ng/g；1μg/g)組上細胞明顯高于poly(EC-CL)和VEGF/poly(EC-CL)(10ng/g)(P<0.05)。間接接觸溶血試驗各組溶血率均<6％，皮下植入試驗膜片四周炎

11、癥反應輕微。當VEGF含量>100ng/g時，可以有效誘導MSC向內皮細胞分化。
　　 結論：Poly(EC-CL)/VEGF共聚物具有良好的細胞相容性、組織相容性和血液相容性，能夠作為生物醫(yī)用植入材料。當VEGF含量>100ng/g時，可以有效誘導MSC向內皮細胞分化。
　　 第四部分組織工程肝臟血管網(wǎng)絡的重建和檢測
　　 目的：完成仿生肝臟三維空間血管網(wǎng)絡的構建，明確這一組織工程實質臟器三維血管網(wǎng)絡構建新方法

12、的可行性。
　　 方法：利用64排CT采集正常人肝臟血管并轉換成4cm×4cm血管斷層平面坐標圖，根據(jù)血管不同斷面平面坐標圖進行激光打孔處理。SEM檢測打孔后，膜片變化。將打孔后的各膜片按次序通過基質膠粘貼在一起。以GFP-腺病毒標記骨髓干細胞誘導的內皮細胞，將標記的內皮細胞灌注于仿生血管網(wǎng)絡中。放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3周檢測血管形成狀況。
　　 結果：激光打孔后，掃描電鏡觀察孔徑邊緣，孔徑邊緣光滑平