基于Endoglin靶大鼠膠質(zhì)瘤的磁共振分子影像學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：合成制備基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體磁共振分子探針并評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)；各種對(duì)比劑大鼠膠質(zhì)瘤磁共振分子影像學(xué)研究，驗(yàn)證探針特異性顯示膠質(zhì)瘤形態(tài)及邊界的有效性。
　　材料與方法：一)空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的制備：(1)脂質(zhì)體膜材料，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇(CHOL)、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、釓-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺(Gd-DTPA-BSA)按36:36:3:25摩爾比例溶于氯仿

2、甲醇混合溶劑(2:1容積)中，經(jīng)40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，60℃水化，高壓均質(zhì)儀擠壓過(guò)膜，制備包載順磁性物質(zhì)(Gd)的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(Gd-SLs)；(2)評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的粒徑、穩(wěn)定性、釓含量、磁共振馳豫率及體外MR成像作用等性質(zhì)。二)基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體及預(yù)定位脂質(zhì)體分子探針的制備：(1)Gd-SLs成膜過(guò)程中，加入膜材料吡啶二硫丙酰基.聚乙二醇(2000)-二硬脂酰乙醇胺(PDP-PEG(2000)-DSPE)，制備表面修飾

3、結(jié)合PDP基團(tuán)脂質(zhì)體(PDP-SLs)，PDP-SLs脂質(zhì)體經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)還原，得表面結(jié)合游離巰基的脂質(zhì)體(HS-SLs)：(2)CD105單克隆抗體(CD105～MAb)與丁二酰亞胺4-(對(duì)-馬來(lái)酰亞胺-苯基)-丁酸酯(SMPB)反應(yīng)制備馬來(lái)酰亞胺苯基丁?；鶈慰寺】贵w(MPB-MAb)：(3)將HS-SLs與MPB-MAb反應(yīng)獲得的表面連接抗體的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(MAb-SLs)；(4)生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羥基琥珀

4、酰亞胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)與CD105～MAb反應(yīng)可得生物素化單克隆抗體(Bio-MAb)；(5)鏈霉親和素結(jié)合空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SAv-SLs)的制備過(guò)程與MAb-SLs基本相同，將HS-SLs與馬來(lái)酰亞胺苯基丁?；溍褂H和素(MPB-SAv)作用，可得SAv-SLs；(6)測(cè)定免疫脂質(zhì)體抗體蛋白密度及抗體結(jié)合率，各種脂質(zhì)體探針透射電鏡觀察形態(tài)。三)大鼠膠質(zhì)瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞Endoglin靶的MR分子成像：(1

5、)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)及膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的建立；(2)25只模型動(dòng)物隨機(jī)分為A～E共5組，每組5只，分別尾靜脈注射釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)、空白脂質(zhì)體(Gd-SLs)、同種型對(duì)照IgG脂質(zhì)體(IgG-SLs)、結(jié)合Endoglin單克隆抗體的免疫脂質(zhì)體探針(MAb-SLs)行MR成像，兩步法預(yù)定位成像大鼠預(yù)先給予生物素化單克隆抗體(Bio-MAb)后再給予鏈霉親和素脂質(zhì)體探針(SAv-SLs)進(jìn)行成像：(3)比較各組大鼠MRT1加權(quán)

6、增強(qiáng)圖像腫瘤強(qiáng)化表現(xiàn)的差異，分析各組動(dòng)脈血管、正常腦組織及肌組織、腫瘤組織時(shí)間.信號(hào)增強(qiáng)特點(diǎn)；(4)比較各組間腫瘤強(qiáng)化程度及強(qiáng)化范圍差異、比較組內(nèi)腫瘤中央部及周邊部強(qiáng)化差異；(5)比較各組間腫瘤強(qiáng)化形態(tài)的差異；(6)大鼠膠質(zhì)瘤CD105免疫組織化學(xué)染色腫瘤中央部及周邊部新生血管計(jì)數(shù)，比較兩者差異。
　　結(jié)果：一)所制備之釓結(jié)合空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(Gd-SLs)經(jīng)高壓均質(zhì)儀過(guò)膜后粒徑控制于117.4±31.8nm；脂質(zhì)體Gd載藥率達(dá)87

7、％～100％；常溫下(26℃)Gd-SLs磁共振馳豫率為Gd-DTPA的1.16倍，37℃為1.25倍；體外MR成像顯示Gd-SLs與Gd-DTPA兩對(duì)比劑MRT1加權(quán)成像作用接近。二)空間穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)合單克隆抗體后粒徑由116.1nm±33.9nm增加至129.9nm±40.9nm，于4℃保存7、14、42天，平均粒徑及分布變化較小；將Bio-MAb與SAv-SLs混合后，平均粒徑顯著增大(267nm±142.8nm)，分布增寬；免疫

8、脂質(zhì)體抗體結(jié)合率為52～67％，相應(yīng)抗體/磷脂比例約為47～60μg/μmol；透射電鏡顯示，脂質(zhì)體為均勻大小囊泡樣結(jié)構(gòu)，將Bio-MAb與SAv-SLs混合后，SAv-SLs有相互聚集作用。三)荷瘤大鼠MR成像(1)動(dòng)脈增強(qiáng)表現(xiàn)：注射Gd-DTPA后，動(dòng)脈血液快速明顯強(qiáng)化，即刻達(dá)峰值，2小時(shí)基本消退，時(shí)間-信號(hào)曲線呈快進(jìn)-快出類型：B～E組大鼠注射相應(yīng)分子探針后，血管強(qiáng)化表現(xiàn)接近，早期快速明顯強(qiáng)化，強(qiáng)化峰值于20～60min出現(xiàn)，之后

9、強(qiáng)化信號(hào)緩慢下降，于48小時(shí)恢復(fù)至增強(qiáng)前水平，其時(shí)間-信號(hào)曲線表現(xiàn)為快進(jìn)-平臺(tái)-緩出類型。(2)腫瘤強(qiáng)化表現(xiàn)：注射Gd-DTPA后，腫瘤迅速?gòu)?qiáng)化達(dá)峰值，20min強(qiáng)化即有減退，2小時(shí)強(qiáng)化信號(hào)約為峰值強(qiáng)度30％，24小時(shí)完全退出；注射Gd-SLs及IgG-SLs，腫瘤早期強(qiáng)化不明顯，60～120min達(dá)峰值呈輕度強(qiáng)化，48小時(shí)強(qiáng)化信號(hào)為峰值強(qiáng)度42～58％；注射MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像，腫瘤周邊及中央信號(hào)迅

10、速增高，于8小時(shí)達(dá)峰值，后緩慢下降，注射MAb-SLs后腫瘤中央周邊強(qiáng)化程度相仿，而兩步法成像周邊強(qiáng)化明顯高于中央部(P=0.032)。(3)腫瘤強(qiáng)化形態(tài)分析顯示，注射Gd-DTPA整個(gè)腫瘤不均勻強(qiáng)化，Gd-SLs及IgG-SLs組以腫瘤邊緣點(diǎn)狀強(qiáng)化為主，MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像腫瘤增強(qiáng)以邊緣環(huán)形強(qiáng)化為主。免疫組織化學(xué)染色顯示，CD105陽(yáng)性微血管主要沿腫瘤周邊分布。
　　結(jié)論：(1)順磁性空間穩(wěn)定

11、脂質(zhì)體能有效提高磁共振分子探針體內(nèi)成像信號(hào)，制備方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)操作可控性好，在一定溫度范圍內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，具有較高的磁共振弛豫作用，是理想的MR分子影像學(xué)對(duì)比劑載體。(2)免疫脂質(zhì)體結(jié)合抗體方法簡(jiǎn)單，效果確切可靠，體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝌?yàn)證生物素-親和素介導(dǎo)的兩步法成像的有效性。(3)大鼠膠質(zhì)瘤MR分子成像，臨床用Gd-DTPA腫瘤強(qiáng)化周邊及中央強(qiáng)度無(wú)差異，非特異性脂質(zhì)體探針腫瘤強(qiáng)化程度低，腫瘤邊界強(qiáng)化形態(tài)不完整，因此均不能用于腫瘤邊界顯示。MA