腦膠質瘤新生血管變化特征與動態(tài)對比增強磁共振成像實驗研究.pdf

1、背景和目的:
　　膠質瘤是威脅人類健康的惡性程度較高的顱內腫瘤，高級別膠質瘤是新生血管最為豐富的惡性腫瘤之一。新生血管是腫瘤組織內新生毛細血管產生、重塑，并形成相對成熟血管的過程，包括血管共生(Vascular co-option)、血管生成(Angiogenesis)、血管發(fā)生(Vasculogenesis)、馬賽克樣新生血管形成(Mosaic vessel formation)、血管擬態(tài)(Vascularmimicry)和膠質

2、母細胞瘤內皮轉分化(Glioblastoma-endothelial cell transdifferentiation)等類型。膠質瘤新生血管的類型和數量在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中存在顯著的差異，不同類型的膠質瘤新生血管對抗腫瘤藥物以及抗血管生成治療的敏感性不同，研究新生血管在膠質瘤生長過程中的動態(tài)變化特征對制定更加有效的抗腫瘤治療方案有積極的促進作用。
　　磁共振成像(Magnetic resonance imaging)技術可以

3、無創(chuàng)的對活體組織進行重復監(jiān)測，在腫瘤診斷、療效監(jiān)測等方面發(fā)揮重大作用。動態(tài)對比增強磁共振成像(Dynamiccontrast-enhanced MRI，DCE-MRI)可以描述血管通透性、有效灌注面積等生理狀態(tài)。目前已應用于惡性程度的分級、療效監(jiān)測等方面，用于新生血管的評價尚無詳細的病理學及影像學的對照研究報道，其多參數的特點尚未得到完全有效的開發(fā)利用。膠質瘤新生血管在組織學上無論是數量還是類型都具有較大的異質性，新生血管對膠質瘤的惡性

4、程度、患者的預后都有重要的影響，DCE-MRI可較好的評價膠質瘤新生血管的功能狀態(tài)。
　　血管出芽、血管共生、血管套疊以及血管擬態(tài)等新生血管方式隨膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)生動態(tài)變化。MRI可以動態(tài)監(jiān)測新生血管及腫瘤細胞的生理、代謝等狀態(tài)，前期工作已經證實Ktrans等參數與膠質瘤微血管密度(Microvessel density，MVD)及腫瘤分級有較好的相關性，其與新生血管類型定量參數的相關性有待進一步的證實。在本實驗中，我們利用

5、膠質瘤原位模型研究膠質瘤新生血管類型的存在形式及其動態(tài)變化過程，同時探討DCE-MRI與新生血管組織學定量參數的相關性，為DCE-MRI顯示新生血管特征和動態(tài)變化過程提供影像學與病理組織學相對應的實驗依據。
　　材料和方法:
　　研究由膠質瘤動物模型新生血管特征的組織學分析以及膠質瘤新生血管特征與磁共振成像相關性研究兩部分組成。動物模型采用三種常用的不同來源的膠質瘤模型，分別為大鼠源性的C6膠質瘤模型和人源性的U87、U25

6、1膠質瘤模型。小動物磁共振成像采用T2 WI以及DCE-MRI技術。
　　1.建立C6、U87、U251膠質瘤原位模型:用量程為20μl的微量進樣器吸取10μl膠質瘤細胞懸液，將注射器固定于腦立體定位儀上，垂直進入腦實質中，控制進針深度為5mm，再回退1mm，手動將膠質瘤細胞懸液緩慢注入腦實質內，控制注射時間為10min左右。注射細胞懸液完畢后留針5min，骨蠟封口。
　　2.動物生存狀態(tài)觀察:記錄每組荷瘤鼠的建模時間與死亡

7、日期，分析、比較荷瘤鼠生存率及半數生存期。
　　3.病理組織學觀察:
　　1) HE染色對腫瘤組織學特點進行觀察;
　　2) CD34、TNC、PAS-CD34免疫組織化學染色判斷并定量分析膠質瘤模型新生血管的類型;
　　3)α-SMA、Desmin免疫組織化學染色研究膠質瘤新生血管的成熟方式;
　　4) PCNA、MMP-2免疫組織化學染色比較不同類型新生血管對腫瘤增殖、侵襲能力的影響;
　　4.膠

8、質瘤MRI動態(tài)觀察
　　1)觀察6個時相點模型膠質瘤的常規(guī)MRI表現及DCE-MRI特征:
　　2)測量6個時相點模型膠質瘤DCE-MRI相關參數，包括Ktrans、Kep、Vp;
　　3)分析比較Ktrans、Kep、Vp值與新生血管類型組織學定量參數之間的相關性。
　　5.統(tǒng)計學分析:應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用(x)±s記錄。使用Kaplan-Meier法計算并繪制三種膠質瘤模型

9、荷瘤鼠的生存曲線，Log-rank檢驗比較三組膠質瘤模型的半數生存期。采用one-way ANOVA方差分析比較三種模型之間組織學定量參數的差異，Ktrans、Kep、Vp及組織學定量的組間差異，t-test比較數據的組內差異。Spearman相關性分析比較MRI參數與新生血管類型定量參數的相關性并計算Pearson相關系數。規(guī)定P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　一、腦膠質瘤原位模型新生血管組織學定量研究
　

10、　1.依照單盲實驗的要求，經兩位病理科醫(yī)生獨立診斷，參考WHO2007年膠質瘤分級的標準，明確C6、U87、U251膠質瘤模型分別對應的人膠質瘤WHOⅢ/Ⅳ的分級診斷。
　　2.生存分析顯示C6大鼠膠質瘤模型半數生存期為30天，U87、U251人源性膠質瘤模型的中位生存時間分別為50和53天。C6模型與其他兩種膠質瘤模型的半數生存期存在統(tǒng)計學差異，U87、U251半數生存期不存在顯著統(tǒng)計學差異。
　　3.三種膠質瘤均具有較強

11、的增殖能力，PCNA指數無統(tǒng)計學差異。
　　4.三種模型新生血管均異常豐富，MVD計數無統(tǒng)計學差異。三種膠質瘤模型新生血管的成熟存在兩種方式:一是α-SMA陽性表達的血管周細胞的募集，二是Desmin陽性的血管壁細胞的募集。U87、U251模型高表達α-SMA陽性的血管周細胞，而C6模型則更多的募集Desmin陽性的血管周細胞。
　　5.TNC染色觀察到三種模型中大部分腫瘤微血管通過血管出芽的方式新生。在模型生存終末期可以觀

12、察到部分腫瘤微血管存在血管套疊生成。HE染色配合CD34、GFAP免疫組織化學染色在膠質瘤瘤旁組織鑒定出血管共生現象。CD34-PAS復染鑒定出膠質瘤壞死周圍存在血管擬態(tài)這種特殊的新生血管類型。除血管擬態(tài)數量無明顯統(tǒng)計學差異外，三種模型之間血管出芽、血管套疊和血管共生均存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　二、腦膠質瘤新生血管動態(tài)變化特征與MRI相關性研究
　　1.C6膠質瘤病理表現:大體標本觀察到荷瘤鼠右側基底節(jié)區(qū)出現

13、“魚肉樣”新生腫塊組織，HE染色見腫塊組織異常豐富的新生血管以及特征性“柵欄樣壞死”，C6膠質瘤組織侵潤性生長的區(qū)域為距腫瘤邊緣約437.8±153.6μm的范圍。
　　2.膠質瘤新生血管存在形式和動態(tài)變化:移植細胞后第12和第16天血管共生現象最少，與其他四個時間點比較有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。6個時相點均顯示血管出芽生長是C6膠質瘤最重要的新生血管方式，不同時相點血管出芽定量有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。血管套疊為

14、在血管腔內見到柱狀分隔，高倍鏡下觀察到血管套疊生長的三個典型階段，即套疊式血管生成、套疊式血管擴張和套疊式血管重塑。血管套疊僅在移植細胞第8天才出現，且隨腫瘤的增大而增多，不同時相點血管套疊數有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。6個時相點，血管擬態(tài)數量較少，均無明顯統(tǒng)計學差異。
　　3.膠質瘤MRI動態(tài)特點:腫瘤體積隨移植推移而逐漸增大（P＜0.05）。腫瘤組織DCE-MRI灌注參數均隨著腫瘤生長不斷升高（P＜0.05）。瘤旁組織Ktr

15、ans、Kep隨腫瘤生長出現“先升高后下降”的變化規(guī)律（P＜0.05），Vp值的變化則無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.MRI參數與組織學參數的相關性:瘤旁組織DCE-MRI灌注參數Ktrans和Kep與C6膠質瘤血管共生指數有較強負相關，Kep、Vp與套疊血管、血管出芽呈正相關(p＜0.05)。
　　結論:
　　1.三種膠質瘤原位模型中均存在四種新生血管類型，即血管出芽，血管共生，血管套疊以及血管擬態(tài)等，不