腦膠質(zhì)瘤光學(xué)和磁共振雙報(bào)告基因成像系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤光學(xué)和磁共振成像雙報(bào)告基因慢病毒系統(tǒng)，在體內(nèi)外驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步檢測(cè)目的蛋白的成像功能。
　　方法：首先構(gòu)建 FTH-EGFP-GV287慢病毒載體，進(jìn)行慢病毒包裝與生產(chǎn)，轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鐵蛋白重鏈、綠色熒光蛋白的細(xì)胞株F98-FTH-EGFP及僅表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株F98-EGFP，體內(nèi)外驗(yàn)證FTH及其標(biāo)記蛋白FLAG的表達(dá)，細(xì)胞及小動(dòng)物水平驗(yàn)證光學(xué)成像的可行性，細(xì)胞及小動(dòng)物水平驗(yàn)證鐵蛋白儲(chǔ)存鐵的

2、功能，驗(yàn)證MRI成像的可行性。
　　結(jié)果：將構(gòu)建的光學(xué)和磁共振成像雙報(bào)告基因慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)免疫組化、WB、免疫熒光驗(yàn)證細(xì)胞成功的表達(dá)了EGFP與FTH。通過(guò)熒光顯微鏡與小動(dòng)物光學(xué)成像儀，驗(yàn)證了體內(nèi)外光學(xué)成像的可行性。但是在進(jìn)行鐵蛋白功能驗(yàn)證時(shí)，得到的是陰性結(jié)果，通過(guò)普魯士藍(lán)染色、原子吸收法均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)鐵的富集，體內(nèi)外MRI上未檢測(cè)到局部T2WI信號(hào)的下降。
　　討論：雖然我們通過(guò)免疫熒光、免疫組化檢測(cè)到了鐵

3、蛋白重鏈的過(guò)表達(dá)，但在鐵蛋白儲(chǔ)存鐵功能驗(yàn)證時(shí)，我們得到的是陰性結(jié)果，通過(guò)閱讀文獻(xiàn)與相關(guān)陽(yáng)性結(jié)果對(duì)比，考慮是由于在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，為了能夠更好的、特異性更高的檢測(cè)到過(guò)表達(dá)的鐵蛋白，我們?cè)阼F蛋白重鏈的C端添加了一個(gè)3FLAG片段，這是由25個(gè)氨基酸所構(gòu)成的標(biāo)簽蛋白，具有親水性，影響了鄰近的亞鐵氧化酶的活性，使過(guò)表達(dá)的鐵蛋白重鏈?zhǔn)パ趸瘉嗚F離子的能力，不能儲(chǔ)存鐵離子。我們后續(xù)又構(gòu)建了一個(gè)不帶標(biāo)簽蛋白的過(guò)表達(dá)鐵蛋白重鏈的質(zhì)粒，用293T初步驗(yàn)證了實(shí)