Tim-3在巨噬細胞活化誘導(dǎo)凋亡中的作用及其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達.pdf

1、本論文開展以下兩方面研究：
　　 第一部分Tim-3在巨噬細胞活化誘導(dǎo)凋亡中的作用及機制研究。
　　 巨噬細胞參與免疫應(yīng)答的各個環(huán)節(jié)，不僅在機體抗感染及清除衰老或損傷細胞、維持自身穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用，而且也可以通過分泌各種炎性因子，介導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，導(dǎo)致機體損傷。因此，調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，防止巨噬細胞過度活化具有重要意義。活化誘導(dǎo)凋亡( activation induced cell death，AICD)是機體防止免疫細

2、胞過度活化的重要機制。巨噬細胞AICD的機制尚未闡明。單核/巨噬細胞高表達Tim-3，但Tim-3在巨噬細胞AICD中的作用及機制尚未見報道。
　　 目的：
　　 建立巨噬細胞AICD的細胞模型，研究Tim-3在巨噬細胞活化誘導(dǎo)凋亡中的作用，并探討其機制。
　　 1、檢測Tim-3在小鼠巨噬細胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細胞中的表達。
　　 1.1、 RT-PCR檢測Tim-3 mRNA的表達；

3、r>　　 挑選6至8周周齡的雄性BalBc小鼠，腹腔注射7％的無菌淀粉溶液。72小時后分離其腹腔巨噬細胞。
　　 1.2、流式細胞術(shù)檢測Tim-3蛋白的表達；
　　 收集新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細胞或?qū)?shù)生長期RAW264.7細胞，以PE標(biāo)記的Tim-3抗體或同型對照抗體進行染色，流式細胞儀檢測Tim-3蛋白的表達。
　　 2、小鼠巨噬細胞AICD模型的建立。
　　 新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細胞或?qū)?shù)生長期

4、小鼠巨噬細胞系RAW264.7以l×105/nil種板，500μl/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后添加刺激。應(yīng)用終濃度10ng/ml的IFN-γ刺激24小時后，再添加終濃度l00ng/ml的LPS共孵育12小時，誘導(dǎo)巨噬細胞的凋亡。
　　 3、Tim-3阻斷實驗。
　　 新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細胞或?qū)?shù)生長期小鼠巨噬細胞系RAW264.7以l×105/ml種板，500μl/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后進行如下刺激：終濃

5、度為5μg/ml的Tim-3阻斷性抗體或IgG對照預(yù)處理l小時后，同上以IFN-γ和LPS誘導(dǎo)巨噬細胞的凋亡。
　　 4、抑制STAT1磷酸化。
　　 小鼠巨噬細胞系RAW264.7以1×l05/ml種板，500μl/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后添加刺激：應(yīng)用STAT1磷酸化抑制劑fludarabine6μM或?qū)φ誔BS預(yù)處理30分鐘后，添加終濃度為5μg/ml的Tim-3阻斷性抗體或IgG對照共孵育l小時，最后同上應(yīng)

6、用IFN-γ和LPS誘導(dǎo)巨噬細胞的凋亡。
　　 5、凋亡檢測。
　　 5.1、 Annexin-V/PI雙染檢測凋亡；
　　 收集待檢測的巨噬細胞，加入2mlPBS后，1000rpm，5min離心，棄去上清后，加入1mlPBS進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至5×105，離心后棄去PBS，加入500μl凋亡檢測用的緩沖液，混勻后，避光添加FITC標(biāo)染的Annexin-V5μl混勻，再添加PI5μl混勻，室溫避光孵育10m

7、in，上流式細胞儀檢測凋亡。
　　 5.2、 TUNEL染色檢測凋亡。
　　 預(yù)先于24孔板內(nèi)鋪上高壓處理的飛片，再種板誘導(dǎo)細胞凋亡。PBS沖洗細胞2次。加入含1μM枸櫞酸鈉鹽的Triton X100(0.1％)溶液冰上孵育10min，對細胞進行打孔。PBS沖洗后滴加酶標(biāo)染色液25μl，置入濕盒內(nèi)37℃避光標(biāo)染30min，熒光顯微鏡觀察，并保存圖像。
　　 6、 Westen Blot檢測p-Ser727-STA

8、T1的表達。
　　 提取細胞總蛋白，并檢測濃度，加入6×loading buffer至1×，混勻，煮沸變性。蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用兔抗鼠p-Ser727-STAT1單克隆抗體作為一抗共孵育1小時，洗膜液洗去一抗，HPR標(biāo)記的羊抗兔的二抗共孵育1小時，洗滌后，ECL顯色液顯色。
　　 結(jié)果：
　　 1、 Tim-3組成性高表達于小鼠腹腔巨噬細胞和小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞。

9、>　　 RT-PCR結(jié)果顯示，RAW264.7細胞和小鼠腹腔巨噬細胞均可擴增出一條明顯的Tim-3條帶。
　　 流式結(jié)果顯示，小鼠腹腔巨噬細胞和巨噬細胞系RAW264.7細胞表面均存在Tim-3蛋白的表達。小鼠腹腔巨噬細胞Tim-3表達(65.9％)高于RAW264.7(28.1％)細胞。
　　 2、成功建立小鼠巨噬細胞AICD模型。
　　 在巨噬細胞系RAW264.7中，流式檢測結(jié)果顯示：單獨應(yīng)用IFN-γ或

10、LPS不能誘導(dǎo)RAW264.7細胞凋亡（IFN-γ刺激組凋亡率為2.443±0.090％;LPS組為0.837±0.432％），而聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ+LPS刺激可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細胞凋亡（33.54±0.1747％，P＜0.05）。TUNEL熒光染色實驗顯示相同的結(jié)果，即單獨IFN-γ或LPS刺激組細胞熒光染色率顯著低于IFN-γ+LPS聯(lián)合應(yīng)用組。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功建立了小鼠巨噬細胞AICD的模型

11、?？贵w阻斷實驗證明Tim-3可以抑制IFN-γ+LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞AICD。Westen blot結(jié)果和STAT1磷酸化抑制劑的應(yīng)用后的流式結(jié)果，均提示，STAT1727位絲氨酸位點的磷酸化可能是Tim-3抑制巨噬細胞AICD的重要機制。
　　 第二部分 Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞中的表達及其臨床意義。
　　 巨噬細胞凋亡異?？梢詫?dǎo)致免疫細胞過度活化，是多種自身免疫病的重要發(fā)病機制之一。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

12、炎(rheumatoid arthritis，RA)，是一種常見的自身免疫性疾病，致殘率高。多種免疫細胞的活化參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。
　　 目的：
　　 檢測Tim-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞上的表達；分析Tim-3表達與疾病活動度的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、流式細胞術(shù)檢測外周血各細胞亞群上Tim-3的表達。
　　 收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康對照者肝素抗凝血，分別標(biāo)

13、染CD3、CD4、CD8、CD16/56、CD14、Tim-3和各色熒光對照抗體，流式細胞術(shù)檢測Tim-3在外周血不同細胞亞群中的表達。
　　 2、血漿腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測
　　 留取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿，于-80℃保存，ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)檢測TNF-α含量。
　　 3、實時定量PCR檢測外周血

14、單個核細胞IL-17mRNA表達
　　 收集RA患者肝素抗凝血，用淋巴細胞分離液分離患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以SYBRgreen熒光探針法進行實時定量PCR檢測IL-17mRNA表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 l、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞(PBMC) Tim-3表達顯著高于健康

15、對照，且Tim-3表達水平與血漿TNF-α含量及疾病活動度負(fù)相關(guān)。
　　 流式結(jié)果顯示RA患者PBMC上Tim-3的表達率（29.38±1.321％）顯著高于健康對照(24.50±1.855％)(P=0.0317)。分析PBMC上Tim-3蛋白的平均熒光強度(MFI)，得到相似結(jié)果，即：RA患者PBMC中Tim-3表達水平(4.926±0.5207)顯著高于健康對照（2.907±0.3082）(P=0.0043)。相關(guān)性分析顯示

16、：RA患者PBMC中Tim-3+細胞比例與血漿TNF-α水平（r=-0.5459，P=0.0070）和疾病活動度指標(biāo)DAS28（r=-0.4318，P=0.0396）均呈現(xiàn)良好的負(fù)相關(guān)。
　　 2、RA患者外周血各T淋巴細胞亞群和單核細胞上Tim-3的表達均顯著升高
　　 流式結(jié)果顯示RA患者外周血各T細胞亞群（CD4+T、CD8+T、NKT細胞）和單核細胞上的Tim-3表達率均顯著高于健康對照。
　　 3、RA

17、患者外周血各T淋巴細胞亞群Tim-3的表達水平均與疾病活動度指標(biāo)DAS28負(fù)相關(guān)。
　　 統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，患者DAS28指數(shù)與CD4+T、CD8+T和NKT細胞上Tim-3的表達水平呈良好負(fù)相關(guān)性(CD4+T細胞：r=-0.4375,P=0.0368;CD8+T細胞：r=-0.4234，P=0.0441;NKT細胞：r=-0.5548,P=0.0060)。
　　 結(jié)論：
　　 1、RA患者外周血單個核細胞上Tim

18、-3的表達明顯高于健康對照；且RA患者Tim-3在T細胞各亞群（CD4+T、CD8+T、CD3+CD16/56+NKT細胞）和單核細胞上的表達均分別高于健康對照。
　　 2、RA患者中，PBMC，尤其是各T細胞各亞群(CD4+T、CD8+T、 CD3+CD16/56+NKT細胞）上Tim-3表達水平與疾病活動度指標(biāo)DAS28負(fù)相關(guān)。
　　 3、RA患者中，Tim-3在CD4+T細胞上的表達率與IL-17mRNA的表達呈良