基于深度測序從全基因組分析母子患者血清HBV準種多態(tài)性.pdf

1、第一部分基于深度測序從全基因組分析母子患者血清HBV準種多態(tài)性
　　目的:通過建立一種快速、高通量的方法，能夠同時對多個樣本進行全基因組深度測序，對母子患者血清乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)病毒準種進行全基因組重測序，從病毒全基因組水平上了解不同患者或同一患者體內(nèi)HBV準種多態(tài)性分布特征，分析母子患者體內(nèi)HBV準種分布的同源性與差異性，為下一步進行疫苗逃逸位點的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供依據(jù)。
　　方法:1、制

2、備HBV全基因組序列:以4對母子患者血清HBV病毒顆粒為模板，PCR擴增HBV3.2kb全長DNA。2、構(gòu)建solexa測序文庫:(1)使用Nextera Technology將HBV DNA的全基因組片段化，處理成5'端帶轉(zhuǎn)座末端序列的小片段。(2)設(shè)計Barcode引物，在轉(zhuǎn)座末端序列的5'端加上Barcode序列，通過PCR給每個樣本加上標簽。(3)膠回收250bp～500bp的目的片段。(4)通過克隆測序驗證上述構(gòu)建的測序文庫。

3、3、將所有樣本等量混合后進行兩次solexa測序。4、對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析:構(gòu)建consensus序列，利用Barcode序列對測序數(shù)據(jù)進行分庫（分庫標準:與barcode序列5'端去掉2個堿基后的序列完全一致），通過和consensus序列對比過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)（過濾標準:Filtered:Reads N＞3，Poly N＞15，測序質(zhì)量值＜30; Low P-score:HBV同源性＜90％），通過分析測序誤差、coverage

4、分布情況、香農(nóng)熵分布情況等參數(shù)，評估實驗方法的可行性和重復(fù)性;同時進一步比較采用不同PCR擴增方案得到HBV全基因組序列和不同酶濃度處理的HBV全長序列的測序數(shù)據(jù)的異同，最后分析了母子患者體內(nèi)病毒準種的同源性和差異。
　　結(jié)果:1、分庫，過濾低質(zhì)量序列后，兩次測序獲得有用序列的效率分別是30.53％和44.88％，平均每個位點的測序深度分別是1043和2733個堿基。測序誤差分別是0.26％和0.23％，所有樣本均能夠100％覆蓋

5、HBV全基因組。所有樣本的coverage分布均表現(xiàn)為相同的規(guī)律，在nt900、nt1800和nt2500區(qū)域表現(xiàn)為低覆蓋。每個樣本兩次測序在coverage分布的比較上沒有差別(P＜0.05)，但在香農(nóng)熵的分布比較上，11個樣本中有3個樣本兩次測序有一定差異。2、不同PCR擴增方案獲得HBV全長序列測序得到的數(shù)據(jù)和不同酶濃度處理的HBV全長序列測序后得到的數(shù)據(jù)在coverage分布的比較上沒有明顯差異(P＜0.05)，但在香農(nóng)熵分布的

6、比較上，第一次測序有差異，第二次測序沒有差異(P＜0.05)。3、母子間準種序列的相對香農(nóng)熵分布可以聚類，非母子間不能聚類。但是母子間序列在S抗原的A決定簇區(qū)域和P、C、X基因的抗原表位的區(qū)域具有差異。
　　結(jié)論:1、結(jié)合Barcode標簽，我們建立了一種高通量的對HBV全基因組進行分析的策略方法，有助于深入分析HBV準種序列特征。
　　2、結(jié)合上述技術(shù)，我們對臨床乙肝病毒感染的4對母子樣本進行了準種分析，發(fā)現(xiàn)不同患者和同一

7、患者體內(nèi)HBV準種分布具有多態(tài)性，并且獲得了患者體內(nèi)HBV準種的序列在每個核苷酸位點上的頻譜。
　　3、通過對母子患者體內(nèi)HBV準種全基因組頻譜的聚類分析，我們發(fā)現(xiàn)母子患者體內(nèi)的HBV準種的相似性高，而非母子患者體內(nèi)的HBV準種的相似性低，從而推測子代患者體內(nèi)的HBV準種來自母親，即HBV的傳播是以垂直傳播為主的。
　　4、分析母子患者體內(nèi)的HBV準種全基因組頻譜的差異性，我們發(fā)現(xiàn)，這些差異性位點多位于HBV疫苗作用的S抗原

8、的A決定簇區(qū)域或抗原表位區(qū)域，這為下一步對疫苗逃逸位點的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供了依據(jù)。
　　第二部分HBV DNA線性結(jié)構(gòu)與環(huán)化結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)染Huh7細胞后HBV復(fù)制水平差異的研究
　　目的:通過比較不同乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）體外復(fù)制體系中分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，H

9、BeAg)和病毒顆粒的復(fù)制水平，表明采用環(huán)化策略的HBV體外復(fù)制體系更適合HBV反轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制研究。
　　方法:1、選擇已經(jīng)構(gòu)建好的3種質(zhì)粒:(1)由CMV啟動的HBV1.1倍體質(zhì)粒(CMV-HBV1.1);(2)由CMV啟動的HBV1.3倍體質(zhì)粒(CMV-HBV1.3);(3)由T載體上的啟動子啟動的HBV1.3倍體質(zhì)粒(T-vector-HBV1.3)。2、任選一個質(zhì)粒用含有BspQI內(nèi)切酶位點的引物擴增HBV全長（本實

10、驗選擇了CMV-HBV1.1）。使用BspQI限制性內(nèi)切酶酶切，然后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建環(huán)化HBV DNA（cyclized-HBV）。3、將三種質(zhì)粒和環(huán)化的HBV DNA轉(zhuǎn)染到Huh7細胞中，5天后收集細胞上清進行ELISA分析，收集細胞并提取HBV復(fù)制中間體DNA進行Southern印跡分析。
　　結(jié)果:1、成功擴增HBV全長片段并構(gòu)建了環(huán)化HBV DNA;2、轉(zhuǎn)染Huh7細胞后，ELISA檢測乙型肝炎病毒表面抗原(