以精胺為基本構建單元并可降解為精胺的聚陽離子基因載體的研究.pdf

1、為了構建安全有效的基因載體，我們用體內天然存在的專職基因凝聚單體一精胺作為基本構建單元，合成了一類能夠并實現基因復合、內吞逃逸、基因釋放和自身無毒化代謝，并且可通過表面修飾進一步兼顧體內循環(huán)和細胞靶向的聚陽離子基因載體。這一類聚陽離子的特點包括：有足夠的質子化氨基形成高密度的正電荷以凝聚帶有負電荷的基因物質；能夠通過降解回到精胺的初始內源性狀態(tài)完成自身的無毒化代謝(因為聚陽離子均有化學毒性)，釋放其所凝聚的基因物質，甚至通過所釋放的精胺

2、的游離氨基協助基因的內吞逃逸。
　　 首先，我們將精胺的四個氨基中的兩個伯胺基選擇性保護后，分別與乙二醇二氯甲酸酯和琥珀酰氯反應聚合成含有氨酯和酰胺結構的聚陽離子，然后進行脫保護置換出伯胺基，經透析去除小分子雜質得到所需分子量的聚陽離子。我們分別命名兩個聚陽離子為Polycarbam-SP和Polyamide-SP。另外，利用乙二醛與未保護的精胺的兩個伯胺反應，合成了通過碳氮雙鍵聚合，并經透析純化得到另一個聚陽離子(命名為Pol

3、ymine-SP)。我們統(tǒng)稱精胺作為骨架的基本構建單元的聚陽離子為Polylink-SP。若在Polylink-SP合成前，對精胺結構的一端進行PEG化，則可容易地制備端頭PEG化的PEG-Polylink-SP。
　　 鑒于聚陽離子的降解在基因輸送過程中的功能，我們考察了三種Polylink-SP在37℃下，pH=7.4的緩沖溶液中的水解速率，其中Polycarbam-SP(含氨酯鍵)和Polyamide-SP(含酰胺鍵)的降

4、解速率較慢,14天后聚合物的平均分子量分別降至66％和34％。而Polymine-SP(含碳氮雙鍵)十幾個小時內即可以大部降解。
　　 聚陽離子基因載體可以通過靜電作用與質粒形成復合物。我們通過凝膠電泳、動態(tài)光散射和ζ電位實驗檢測考察了上述三種Polylink-SP凝聚基因物質形成納米顆粒(Polyplex)的能力。在凝膠電泳上，通過氨酯和酰胺鍵連接的聚陽離子(Polycarbam-SP和Polyamide-SP)與DNA質粒的

5、質量比達到3時，DNA的遷移帶完全消失，說明DNA已被可聚陽離子完全凝聚。通過碳氮雙鍵連接的聚陽離子(Polymine-SP)在質量比為1時，DNA在電泳上的遷移就完全消失。這可能部分地由于Polyimine-SP的氨基密度(單位質量擁有的氨基)大于另外兩個聚陽離子1.4倍，部分地由于Polymine-SP的分子量更大。質量比3-12之間時，上述三種聚陽離子與基因形成的復合物的粒徑都在200nm以下，電勢在40mV或30mV以下，這些特

6、性表明該類聚合物能夠有效地將基因凝聚成納米顆粒。
　　 更為重要的是這些Polylink-SP系列的聚陽離子用于基因轉染時顯示了與常用基因轉染試劑(只能作為實驗試劑而因毒性不能走向臨床的聚陽離子)相當或更好的生物活性。Polycarbam-SP和Polyamide-SP用于熒光素酶和綠色熒光蛋白兩種報告基因在COS-7和293ft細胞中的表達時，其效率與陽性對照組——分子量為25kDa的Polyethylenimine(PEI-

7、25KDa)相當。而Polymine-SP在最佳聚陽離子/基因質量為7時，對相同報告基因的COS-7細胞轉染效率比陽性對照組高出一個數量級。同樣有意義的是Polylink-SP系列的聚陽離子對于COS-7細胞的毒性均低于PEI-25KDa，特別是其中基因轉染活性最高的Polyimine-SP的細胞毒性是其中最低的。這一結果(雖然還有待更多的重復實驗確認)初步支持了我們設計思路，即聚陽離子的適時降解同時完成了兩個有意義的動作：基因物質在細

8、胞中的釋放及聚陽離子本身在細胞中的代謝。
　　 與其它聚陽離子基因載體一樣，對Polylink-SP系列進行PEG化，進一步降低了細胞毒性，有些聚陽離子在實驗范圍內幾乎沒有顯示出細胞毒性。另外，熒光探針示蹤實驗表明，Polylink-SP系列的聚陽離子與熒光基因形成的納米顆粒(Polyplex)附著在細胞核表面，證明了載體的內吞逃逸效益。siRNA基因沉默實驗中，聚合物也顯示出較高的基因沉默作用。
　　 作為總結，我們利