水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因OsA8對(duì)氮磷鉀的響應(yīng)特征及功能分析.pdf

1、分子生物學(xué)的迅速發(fā)展為植物營養(yǎng)學(xué)科的深入研究提供了豐富的材料和有效的研究方法，使進(jìn)一步揭示植物營養(yǎng)養(yǎng)分吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)理成為可能.近二十多年來，根據(jù)Mitchell的化學(xué)滲透假說，對(duì)植物細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)和電生理的研究已經(jīng)初步闡明了溶質(zhì)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制.由于H+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)形成的質(zhì)子電化學(xué)梯度所引起的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力與各種溶質(zhì)分子和各種生長調(diào)節(jié)因子等主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相偶聯(lián)，使得H+-ATPase在養(yǎng)分吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配，以及植物生長發(fā)育等方面的重要作

2、用逐漸被重視.然而在植物體內(nèi)數(shù)量眾多的ATPase家族基因中只有及少幾個(gè)基因的生理功能得到闡明.目前調(diào)控水稻礦質(zhì)營養(yǎng)方面的單個(gè)質(zhì)膜H+-ATPase作用及其調(diào)控機(jī)理尚未見報(bào)道.氮磷鉀是植物必需同時(shí)又是土壤中經(jīng)常缺乏的三大營養(yǎng)元素，特別是土壤中磷的移動(dòng)性差和有效性低，植物適應(yīng)低磷營養(yǎng)的機(jī)理受到了廣泛的關(guān)注.已經(jīng)有證據(jù)表明，植物養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)與質(zhì)膜質(zhì)子泵的活性有關(guān).水稻是模式作物和我國重要的糧食作物，水稻全基因組中，總共有10個(gè)屬于質(zhì)膜質(zhì)

3、子泵的基因.開展與氮磷鉀營養(yǎng)有關(guān)的水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵ATPase基因的功能研究，對(duì)揭示植物高效調(diào)控吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)的機(jī)理以及植物的品種改良具有重要意義. 本文以一個(gè)水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因OsA8完全敲除的OsA8純合突變體(Tos17插入突變)和其野生型植株(Oryze Sativa ssp. Japonica cv. Hitomebore)為材料，對(duì)比研究在不同磷、鉀、氮條件下突變體和野生型植株的形態(tài)和生理特征及分子響應(yīng)機(jī)制，探討OsA

4、8基因的功能.主要結(jié)果如下： 1.在正常營養(yǎng)供應(yīng)條件下OsA8基因在水稻葉片和缺磷條件下根系中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平比較低.值得注意的是與已經(jīng)報(bào)道的大豆中質(zhì)膜H+-ATPase總活性受磷缺乏增強(qiáng)不同，OsA8在缺磷條件下葉片中表達(dá)受到抑制，根系中表達(dá)增強(qiáng)；水稻缺氮或缺鉀也降低OsA8基因的表達(dá)，但其幅度相對(duì)缺磷引起的變化較小. 2.以日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所水稻基因組資源中心(Rice Genome resource ce

5、nter，National Institute of Agrobiological Science，Japan)提供的突變體H0310為材料，分別用抑制PCR和反向PCR方法，鑒定并得到了14個(gè)OsA8純合突變株.RT-PCR分析進(jìn)一步確認(rèn)該基因在純合突變體中沒有表達(dá). 3.敲除OsA8基因能減少水稻根系和地上部分的生物量并改變植株的形態(tài).在水培條件下，無論是缺磷或正常供應(yīng)磷處理，OsA8突變體水稻根系的總根長、總體積以及表面積

6、和根尖數(shù)都較野生型植株的小.然而，正常營養(yǎng)條件下OsA8突變體根系的平均半徑無明顯變化，但在缺磷條件下其根系的平均半徑降低，而且初生根的半徑則有所增加.突變體地上部分表現(xiàn)為分蘗數(shù)減少并且分蘗延遲，但株高的影響不明顯. 4.與該基因的表達(dá)特性吻合的是，我們通過水培和砂培試驗(yàn)證明了OsA8與磷的吸收，特別是磷從根系到地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)有明顯的相關(guān)性.在缺磷條件下突變體的根系中磷濃度顯著高于野生型植株；在正常供磷條件下其磷濃度沒有顯著差異

7、.在正常供磷條件下，突變體地上部分磷濃度明顯降低；但在缺磷條件下沒有顯著差別.表明突變體水稻根系中磷向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)受到了明顯的抑制. 5.OsA8對(duì)硝態(tài)氮、鉀的缺乏也有響應(yīng)，但其影響程度遠(yuǎn)沒有對(duì)磷的響應(yīng)程度高.不同氮鉀處理?xiàng)l件對(duì)OsA8突變體植株的形態(tài)沒有明顯的影響；在養(yǎng)分吸收方面，OsA8突變體中鉀和硝態(tài)氮的吸收受到抑制，但提高根系向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn). 6.除了對(duì)硝態(tài)氮、磷、鉀吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，敲除OsA8還顯著增加了

8、水稻根系中可溶性糖的含量，與此一致的是，突變體中H+-ATPase活性，根系還原酶活性都高于野生型植株；生物量明顯降低，表明突變體消耗比較多的能量也不能完全彌補(bǔ)敲除OsA8的影響. 7.通過RT-PCR分析，我們的結(jié)果顯示OsA家族基因中部分基因分別響應(yīng)磷、鉀和氮形態(tài)的變化，這些基因表達(dá)水平的變化比較復(fù)雜，原因可能與其擔(dān)負(fù)的功能復(fù)雜程度有關(guān). 8.對(duì)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Phtl家族中各基因的分析表明：OsPT6基因的表達(dá)與植株中O

9、sA家族基因的表達(dá)(或H+-ATPase活性)有明顯的關(guān)系.并且Phtl家族大部分基因的表達(dá)強(qiáng)度與所分析的組織中磷的含量呈負(fù)相關(guān). 總之，通過對(duì)突變體的分析，我們發(fā)現(xiàn)水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因OsA8的功能與水稻磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，硝態(tài)氮、鉀的吸收及其轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān).敲除OsA8影響Phtl家族OsA家族部分基因的表達(dá)水平以及根系活力、可溶性糖含量、H+-ATPase活性.因此，維持OsA8的表達(dá)對(duì)保持氮磷鉀的充分吸收利用和植株的正常形態(tài)有重要作