油菜花藥發(fā)育相關(guān)基因BnCYP704B1順?lè)醋饔靡蜃拥难芯?pdf

1、BnCYP704B1基因是甘藍(lán)型油菜隱性核不育兩系型S45AB的育性恢復(fù)基因。研究表明，該基因顯著表達(dá)于花藥發(fā)育四分體時(shí)期絨氈層結(jié)構(gòu)，編碼中長(zhǎng)鏈脂肪酸羥化酶，參與絨氈層形成和PCD過(guò)程中的脂類(lèi)代謝。該基因表達(dá)具有顯著的時(shí)空特異性。本研究旨在利用啟動(dòng)子表達(dá)分析和酵母單雜交技術(shù)尋找該基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，豐富和完善油菜花藥發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.油菜BnCYP704B1核心啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)
　　擴(kuò)增油菜BnC

2、YP704B1起始密碼子上游1085bp為啟動(dòng)子區(qū)段。并根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)對(duì)該區(qū)段以616、466、340、203、101和80bp長(zhǎng)度進(jìn)行5'端截短，分別命名Pms1616、Pms1466、Pms1340、Pms1203、Pms1101、Pms180，對(duì)重組載體和空載對(duì)照Pck以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，對(duì)獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株花蕾進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。染色結(jié)果顯示:Pms1616、Pms1466、Pms1340、Pms1

3、203缺失載體花蕾中存在GUS基因的藍(lán)色信號(hào)。Pms1101、Pms180缺失載體和空載對(duì)照Pck花蕾中均無(wú)GUS信號(hào)。以此推測(cè)，在起始密碼子上游-203bp～-101bp區(qū)段存在驅(qū)動(dòng)BnCYP704B1在花藥中表達(dá)的順式作用元件。
　　2.油菜BnCYP704B1調(diào)控基因的挖掘
　　用上述順式作用元件構(gòu)建酵母單雜交誘餌載體Pro45-AbAi，通過(guò)誘餌菌株自激活濃度測(cè)定，確定AbA濃度為100ng/mL時(shí)可有效抑制菌株的自

4、激活該效應(yīng)。以該濃度篩選油菜花蕾cDNA文庫(kù)，篩得到三個(gè)完整的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。在油菜中克隆上述基因，DNA-蛋白質(zhì)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明得這些基因與P45-AbAi相互作用。
　　3.調(diào)控基因的遺傳學(xué)驗(yàn)證
　　在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比對(duì)得這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的同源基因?yàn)閍t4g17695(KAN3)、at3g12730、at4g13640(PHR3)。挑選這些基因的T-DNA插入突變體和激活標(biāo)簽突變體。根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)特異性引物PCR鑒定