油菜花藥中胼胝質(zhì)降解相關(guān)基因MSR66功能分析.pdf

1、甘藍(lán)型油菜隱性核不育7365A中，不育發(fā)生的重要現(xiàn)象之一是減數(shù)分裂后，四分體內(nèi)胼胝質(zhì)無法降解，小孢子以四聚體形式粘連在一起。在7365A和7365B中，利用SSH文庫和Northern雜交分析出76個(gè)表達(dá)有差異基因，其中的MSR66基因在7365A中延遲表達(dá)，本論文對(duì)MSR66基因進(jìn)行了以下功能分析:
　　1.生化分析:利用MSR66基因構(gòu)建原核表達(dá)載體，分離表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行酶活實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物能有效降解β-1，3-葡聚糖，這表明M

2、SR66編碼一個(gè)β-1，3-葡聚糖酶。
　　2.表達(dá)模式分析:利用MSR66基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因，檢測(cè)該基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明:對(duì)轉(zhuǎn)化單株進(jìn)行GUS染色，僅在花蕾中可觀察GUS活性，GUS顏色由內(nèi)而外逐漸變淺。細(xì)胞學(xué)觀察，在花藥發(fā)育的第9期、第10期均有高表達(dá)，而到第11期時(shí)，表達(dá)量就極少。
　　GUS染色及半薄切片結(jié)果表明，該基因在花藥特異表達(dá)。
　　3.亞細(xì)胞定位:利用MSR66基因融合GFP信號(hào)，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)

3、體，結(jié)果表明該基因的表達(dá)產(chǎn)物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。
　　4.提前表達(dá)分析:對(duì)MSR66基因的全ORF和去X8結(jié)構(gòu)域的部分ORF構(gòu)建提前表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅僅去X8結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化單株出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，基本沒有花粉，整個(gè)花藥皺縮;亞歷山大染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化單株花粉只有極少數(shù)被染上。
　　透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化單株花藥發(fā)育過程中，胼胝質(zhì)出現(xiàn)提前降解，后期釋放的小孢子嚴(yán)重液泡化，出現(xiàn)壞死情況，并且沒有形成花粉外壁典型的頂蓋與柱狀體結(jié)構(gòu)，而是融合成似