ANK1基因在弓形蟲生長發(fā)育中的作用研究.pdf

1、弓形蟲是一種宿主范圍廣泛的人畜共患寄生蟲，可感染包括人在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?，全世界約有四分之一的人口感染弓形蟲病。免疫力正常的宿主感染弓形蟲后，在宿主免疫壓力的作用下，弓形蟲會(huì)在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)變成緩殖子，以組織包囊形式存在，造成機(jī)體的終生慢性感染。當(dāng)機(jī)體的免疫力下降時(shí)，包囊內(nèi)的緩殖子會(huì)再活化，形成速殖子，造成宿主急性感染。弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化在弓形蟲病傳播與發(fā)病中起到重要作用。在弓形蟲速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化過程中，約有400個(gè)基因的表

2、達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化，但是這些基因在緩殖子形成中的作用仍不清楚，而鑒定它們?cè)诰徶匙有纬芍械淖饔每梢詾槔斫饩徶匙影l(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為弓形蟲疫苗設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
　　本研究選取一個(gè)含有三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域的緩殖子期上調(diào)基因ANK1，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將ANK1基因在PRU株中敲除，獲得了ANK1基因缺失株，通過比較敲除株與野生株生長、復(fù)制和毒力的差異，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，敲除株在生長、復(fù)制和毒力方面均有缺陷。具體工作包括以

3、下幾個(gè)方面:
　　(1)ANK1蛋白N-端及全長的原核表達(dá)
　　構(gòu)建pE-SUMO-ANK1-Nter和pE-SUMO-ANK1原核表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中并進(jìn)行原核表達(dá)。在37℃誘導(dǎo)條件下，ANK1蛋白N端和全長均能得到高效表達(dá)，但ANK1蛋白全長主要以包涵體的形式存在。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大腸桿菌OD600值達(dá)1.5時(shí)，16℃用終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)可提高蛋白在上清中的表達(dá)量

4、。
　　(2)ANK1敲除株的構(gòu)建
　　利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)ANK1基因進(jìn)行敲除。首先，構(gòu)建ANK1基因特異性CRISPR質(zhì)粒pSAG1-Cas9-U6-ANK1和同源模板質(zhì)粒pANK1-DHFR，然后將同源模板片段和pSAG1-Cas9-U6-ANK1質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)到PRU速殖子中，用乙胺嘧啶進(jìn)行篩選并用限制稀釋法在96孔板中獲取單克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示成功獲得ANK1敲除株。
　　(3

5、)ANK1敲除株表型研究
　　通過空斑實(shí)驗(yàn)比較敲除株和野生株生長的差異，發(fā)現(xiàn)敲除株的生長明顯比野生株慢;通過復(fù)制實(shí)驗(yàn)比較野生株和敲除株在蟲體復(fù)制方面的差異，發(fā)現(xiàn)與野生株相比敲除株在復(fù)制方面有明顯的缺陷;通過小鼠毒力實(shí)驗(yàn)比較野生株和敲除株對(duì)小鼠的毒力情況，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，敲除株的毒力明顯下降。小鼠保護(hù)力實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)ANK1敲除株免疫的小鼠對(duì)致死劑量的野生型蟲株有很好的抗性，證明了敲除株的免疫保護(hù)性為100％。
　　(4) R

6、NA-seq尋找野生株與敲除株的基因表達(dá)差異
　　體外培養(yǎng)敲除株和野生株獲得速殖子，體外堿性誘導(dǎo)敲除株和野生株形成緩殖子，提取速殖子和緩殖子RNA，利用RNA-seq尋找野生株與敲除株表達(dá)量有差異的基因。本研究中，共找到430個(gè)緩殖子期敲除株和野生株表達(dá)量有差異的基因;510個(gè)速殖子期敲除株和野生株表達(dá)有差異的基因。
　　本研究利用CRISPR/Cas技術(shù)將ANK1基因在PRU中進(jìn)行敲除，成功獲得單克隆敲除株。與野生株P(guān)RU