左卡尼汀和甘露糖醛酸寡糖對(duì)高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是2型糖尿病最常見的并發(fā)癥，目前已成為最主要的致盲眼病之一。DR的發(fā)生機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是其中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)分別探討了左卡尼汀(L-Carnitine，LC)及褐藻酸寡糖抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用。首先考察了糖尿病及其并發(fā)癥（尤其是DR）患者血漿左卡尼汀、乙酰左卡尼汀(Acetyl-L-carnitine，ALC)和丙酰左卡尼汀(Propio

2、nyl-L-carnitine，PLC)的含量變化;通過建立高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells，RGCs)凋亡模型，觀察高糖狀態(tài)下RGCs凋亡情況，探討LC和不同分子量甘露糖醛酸對(duì)高糖狀態(tài)下RGCs凋亡的保護(hù)作用及抗氧化機(jī)制;著重研究了LC對(duì)Nrf2-Keap1-ARE通路的調(diào)控作用;最后，對(duì)兩種組分的協(xié)同作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　(1)非干預(yù)收集健康志愿者（76例）、2型糖尿病患者（59例）以及糖

3、尿病并發(fā)癥患者（糖尿病視網(wǎng)膜病變74例、早期糖尿病腎病51例、糖尿病周圍神經(jīng)病變57例、糖尿病高血壓69例、糖尿病性冠心病64例）的臨床指標(biāo)及血漿樣本，采用柱前衍生熒光HPLC法檢測(cè)LC、ALC和PLC的含量。結(jié)果表明糖尿病組的血漿LC濃度明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05），其他并發(fā)癥組LC濃度又明顯低于糖尿病組（P＜0.05），但各并發(fā)癥組間比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果提示對(duì)于糖尿病患者，尤其是糖尿病并發(fā)癥患者來說，補(bǔ)充LC可

4、能是有益的。
　　(2)高糖狀態(tài)下，LC對(duì)高糖狀態(tài)下RGCs凋亡的保護(hù)作用及其抗氧化機(jī)制。原代培養(yǎng)RGCs，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的存活情況，最終選擇30mmol·L-1葡萄糖濃度干預(yù)48 h，建立高糖模型;MTT法測(cè)定細(xì)胞活力提示以50-200μmol·L-1 LC促細(xì)胞活性作用最佳;Hoechst33342染色結(jié)果顯示不同濃度LC組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖損傷組（P＜0.01或P＜0.05），提示LC能夠抑制高糖所致的RGC

5、s凋亡。LC組活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平較高糖損傷組顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性以及總抗氧化能力(Totalanti-oxidation ca

6、pability，T-AOC)與模型組相比較顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），且效應(yīng)呈劑量依賴性。結(jié)果提示LC可通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力抑制高糖所致的細(xì)胞凋亡。
　　(3)高糖狀態(tài)下，LC對(duì)RGCs凋亡過程中Nrf2-Keap1-ARE通路的調(diào)控作用。結(jié)果顯示LC組Nrf2蛋白表達(dá)比高糖組顯著增多(P＜0.01或P＜0.05);而Keap1蛋白表達(dá)與高糖組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），血紅素加氧酶(HO-1)和γ-谷氨酰

7、半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的蛋白表達(dá)均比高糖組顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，且呈劑量依賴性，提示LC可能通過激活Nrf2-Keap1-ARE通路，增加下游抗氧化物酶HO-1和Ⅱ相解毒酶γ-GCS的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)高糖狀態(tài)下RGCs的氧化應(yīng)激性損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　(4)在課題組前期鑒定出甘露糖醛酸M段的四個(gè)組分(MH-1、MH-2、MH-3、MH-4)的基礎(chǔ)上，探討不同分子量的甘露糖醛酸預(yù)處理對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，在10-100

8、0μg·ml-1范圍內(nèi)不同分子量的甘露糖醛酸可拮抗高糖對(duì)RGCs凋亡的影響(P＜0.01)。Hoechst33342染色顯示不同分子量甘露糖醛酸均能夠抑制高糖損傷所致的RGCs凋亡，其在濃度為100tg·ml-1時(shí)的保護(hù)作用排序?yàn)镸H-1＞MH-2＞MH-4＞MH-3;不同分子量甘露糖醛酸組ROS水平較高糖組顯著下降(P＜0.01)，均能逆轉(zhuǎn)高糖引起的MDA的升高(P＜0.01)，減輕脂質(zhì)過氧化，抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT活性

9、以及T-AOC與高糖組相比均顯著升高(P＜0.05)。結(jié)果提示不同分子量甘露糖醛酸可通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力抑制高糖所致的細(xì)胞凋亡。
　　(5)探討左卡尼汀與甘露糖醛酸寡糖對(duì)高糖誘導(dǎo)RGCs凋亡的協(xié)同保護(hù)作用。選擇對(duì)RGCs凋亡保護(hù)作用最強(qiáng)的MH-1三個(gè)濃度分別與LC混合，Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在相同條件下，甘露糖醛酸寡糖MH-1段對(duì)RGCs凋亡的保護(hù)作用略低于左卡尼汀。三組混合組凋亡率比較發(fā)現(xiàn)，低濃度混合

10、組對(duì)RGCs凋亡的保護(hù)作用高于低濃度LC組，又高于低濃度MH-1組和中濃度MH-1組，中濃度混合組對(duì)RGCs凋亡的保護(hù)作用高于MH-1(M)組，與LC(M)無(wú)顯著性差異，高濃度混合組對(duì)RGCs凋亡的保護(hù)作用高于MH-1(H)組，與LC(H)組無(wú)顯著性差異，LC和甘露糖醛酸寡糖低、中、高濃度聯(lián)合組的CDI(The coefficient of drug interaction)分別為0.598，、0.971、1.350。說明左卡尼汀與甘露