中華絨螯蟹新型免疫調(diào)節(jié)劑及其酚氧化酶的純化和性質(zhì)研究.pdf

1、本文綜述了甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制研究的現(xiàn)狀及最新進(jìn)展,首次比較系統(tǒng)地研究了左旋咪唑、米糠多糖,山藥多糖及CpG寡脫氧核苷酸(ODN-2006)對(duì)中華絨螯蟹(Eriociteir sinensis)免疫功能和抗病力的影響；探討了ODN-2006觸發(fā)中華絨螯蟹血細(xì)胞酚氧化酶原激活系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；從中華絨螯蟹血細(xì)胞破碎物上清液中分離純化到了酚氧化酶并對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下： (1)左旋咪唑?qū)χ腥A絨螯蟹免疫功

2、能及抗病力的影響 為研究飼料添加左旋咪唑(levamjisole,LMS)對(duì)中華絨螯蟹的免疫調(diào)節(jié)作用,以0(對(duì)照),100、200和300mg·kg-1干飼料的劑量將LMS添加于基礎(chǔ)飼料中,制成顆粒飼料投喂中華絨螯蟹7 d,然后投喂不舍LMS的對(duì)照組飼料。在投喂含LMS的飼料之前(0周)和投喂后2、4、6、8周,采樣測(cè)定中華絨螯蟹的血細(xì)胞總數(shù)(THC)、不同血細(xì)胞數(shù)量(DHC)、吞噬活性、呼吸爆發(fā)(超氧陰離子的釋放)、酚氧化酶(

3、PO)活性和溶菌酶(LSZ)活性；并在投喂含LMS的飼料后的第4周,按1.2×107 cfu·kg-1體重的劑量,體腔注射接種中華絨螯蟹致病性嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株,記錄接種10d后中華絨螯蟹的累積死亡率。結(jié)果顯示,各LMS處理組的THC、透明細(xì)胞(HC)數(shù)量、吞噬百分率(PP)、呼吸爆發(fā)、PO活性和LSZ活性均顯著地高于對(duì)照組(P<0.05);顆粒細(xì)胞(GC)數(shù)量、血細(xì)胞吞噬指數(shù)(P

4、I)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05);LMS處理的中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力明顯增強(qiáng)。由此表明,飼喂適量的LMS可增強(qiáng)中華絨螯蟹的免疫力和抗病力；在試驗(yàn)條件下,200 mg·kg-1干飼料的劑量為最適添加劑量；LMS可作為中華絨螯蟹的新型免疫調(diào)節(jié)劑在疾病預(yù)防中使用。 (2)兩種植物多糖對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的調(diào)節(jié)作用 為研究飼料添加米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP)和山藥多糖(Ch

5、inese yam polysaccharide,CYP)這兩種高等植物多糖對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的調(diào)節(jié)作用,將RBP、CYP按0(對(duì)照)、1.0、2.0和4.0 g·kg-1干飼料的劑量添加于基礎(chǔ)飼料中投喂中華絨螯蟹,采取間隔投喂的策略,即每投喂7天試驗(yàn)飼料后再投喂7天對(duì)照飼料,整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)6周。在試驗(yàn)開始后1、2、4、6周采樣,對(duì)中華絨螯蟹的一系列免疫學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定,并在試驗(yàn)開始后2周,按1.2×107 cfu·kg-1體重的劑量,體

6、腔注射接種中華絨螯蟹致病性嗜水氣單胞菌CL9920菌株,記錄接種7 d后中華絨螯蟹的累積死亡率。結(jié)果顯示,飼料添加2.0～4.0 g·kg-1的RBP、1.0～20 g·kg-1的CYP能顯著地提高中華絨螯蟹的THC和HC數(shù)量(P<0.05),顯著地增強(qiáng)血細(xì)胞的吞噬活性和HLS的PO活性(P<0.05),顯著地提高血清POD、SOD、ACP、ALP活性及抗菌活性(P<0.05),并能明顯地增強(qiáng)中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力,但對(duì)血清L

7、SZ活性的影響沒有規(guī)律性。上述結(jié)果表明,飼喂2.0～4.0 g·kg-1的RBP或1.0～2.0 g·kg-1的CYP能顯著地增強(qiáng)中華絨螯蟹的免疫功能和抗病力；兩種植物多糖可作為中華絨螯蟹的新型免疫調(diào)節(jié)劑在養(yǎng)殖生產(chǎn)中試用。 (3)CpG寡脫氧核苷酸對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的調(diào)節(jié)作用 將ODN-2006(含3個(gè)CpG基序),ODN-R(含1個(gè)反向CpG基序)按0(對(duì)照)、1、5和25 μg·kg-1體重的劑量體腔注射中華絨螯蟹

8、(0.1 mL·只-1),同時(shí)設(shè)注射等體積的0.85％生理鹽水的對(duì)照組,研究了兩種ODN對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的調(diào)節(jié)作用。在注射ODNs或生理鹽水之前(0 d)和注射后第1、3、5、8 d采樣,對(duì)中華絨螯蟹的一系列免疫學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定,并在注射ODNS后第3 d,按1.2×107 cfu·kg-1體重的劑量,體腔注射接種中華絨螯蟹致病性嗜水氣單胞菌CL9920菌株,記錄接種7 d后中華絨螯蟹的累積死亡率。結(jié)果顯示,25 μg·kg-1ODN

9、-2006能顯著地提高中華絨螯蟹的THC、吞噬活性和呼吸爆發(fā)活性(P<0.05),顯著地增強(qiáng)血清PO、SOD、ACP、ALP、溶血素及抗菌活性(P<0.05),但對(duì)中華絨螯蟹的DHC、血清POD及LSZ活性沒有顯著影響(P>0.05)。此外,25 μg·kg-1 ODN-2006能明顯地增強(qiáng)中華絨螯蟹對(duì)致病性嗜水氣單胞菌的抵抗力。與此相對(duì),25 μg·kg-1ODN-R除對(duì)血清PO活性具有顯著的增強(qiáng)作用外(P<0.05),對(duì)其他免疫學(xué)參

10、數(shù)沒有明顯的影響(P>0.05)。上述結(jié)果表明,ODN-2006能顯著地增強(qiáng)中華絨螯蟹的免疫功能和抵抗力,是中華絨螯蟹潛在的新型免疫調(diào)節(jié)劑,可進(jìn)一步加以研發(fā)和利用。 (4)CpG寡脫氧核苷酸觸發(fā)中華絨螯蟹proPO激活系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 以0、5、10、15、20和25 μg·mL-1濃度的ODN-2006體外處理中華絨螯蟹血細(xì)胞30min,研究了ODN-2006對(duì)中華絨螯蟹PO活性的影響。結(jié)果顯示,10 μg·mL-1

11、以上濃度的ODN-2006能顯著地增強(qiáng)血細(xì)胞胞內(nèi)外受ODN刺激的PO(POs)活性及胞外總PO(POT)活性(P<0.05),但胞內(nèi)POT活性有所下降；ODN-2006誘導(dǎo)的胞內(nèi)外PO活性的上升或下降均顯示出劑量依賴性。由此表明,在試驗(yàn)條件下,ODN-2006能刺激中華絨螯蟹血細(xì)胞脫顆粒,但不能刺激血細(xì)胞合成新的proPO。進(jìn)一步以10 μg·L-1ODN-2006和一定濃度的特異性信號(hào)激活劑或抑制劑分別單獨(dú)或聯(lián)合體外處理中華絨螯蟹血細(xì)

12、胞30 min,通過檢測(cè)血細(xì)胞胞內(nèi)外PO活性的增減情況,對(duì)ODN-2006觸發(fā)proPO激活系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示,用氟化鈉(G蛋白激活劑)處理血細(xì)胞,胞內(nèi)外POT活性均增加；用8-Br-cAMP(PKA激活荊)或咖啡因(磷酸二酯酶抑制劑)或白屈菜赤堿(PKC抑制劑)處理血細(xì)胞,胞內(nèi)POT活性增加,胞外POT活性下降；用佛波酯(PMA,PKC激活劑)處理血細(xì)胞,胞外POT活性增加,胞內(nèi)POT活性下降；用三羥基異黃酮(酪氨

13、酸蛋白激酶抑制劑)處理血細(xì)胞,胞內(nèi)外POs活性及胞外POT活性均上升,胞內(nèi)POT活性下降。當(dāng)用白屈菜赤堿和ODN-2006或PMA共同處理血細(xì)胞時(shí),白屈菜赤堿對(duì)ODN或PMA誘導(dǎo)增強(qiáng)的胞內(nèi)外POs活性及胞外POT活性具有較強(qiáng)的抑制作用。此外,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟化鈉、PMA及三羥基異黃酮與ODN-2006對(duì)血細(xì)胞脫顆粒具有協(xié)同刺激作用,ODN-2006可部分地解除被8-Br-cAMP、咖啡因或白屈菜赤堿對(duì)血細(xì)胞脫顆粒的抑制作用。上述結(jié)果表明,OD

14、N-2006可能經(jīng)由G-蛋白介導(dǎo)的PKC途徑活化中華絨螯蟹血細(xì)胞proPO系統(tǒng),并通過酪氨酸蛋白激酶途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控。 (5)中華絨螯蟹酚氧化酶的分離純化及其生物化學(xué)性質(zhì) 以中華絨螯蟹的HLS為材料,利用凝膠過濾和離子交換層析等方法,對(duì)中華絨螯蟹的酚氧化酶(PO)進(jìn)行了分離純化和生物化學(xué)性質(zhì)研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹酚氧化酶原(proPO)的相對(duì)分子質(zhì)量約為76.4kDa,在試驗(yàn)操作過程中極易發(fā)生降解或自身降解,變成有活性

15、的大小約70.1 kDa的PO。以L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)為特異性底物對(duì)PO活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹PO的最適溫度為40℃,最適pH值為7.0,對(duì)L-DOPA和鄰苯二酚的Km值分別約為2.63 mmol·L-1和6.25 mmol·L-1。中華絨螯蟹PO對(duì)苯硫脲極為敏感,對(duì)硫脲、半胱氨酸、抗壞血酸及苯甲酸也很敏感。根據(jù)中華緘螯蟹PO對(duì)抑制劑的敏感性和對(duì)底物的親和力,將其鑒定為鄰二酚氧化酶(o-diphenoloxidase)