VEGF-PKD1-HDAC7軸調(diào)控循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與非霍奇金淋巴瘤血管形成的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞在非霍奇金淋巴瘤血管形成中的作用
　　目的：建立一種體外培養(yǎng)原代內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法;同時(shí)研究該細(xì)胞在非霍奇金淋巴瘤血管形成中的作用。
　　方法：以人臍血中單個(gè)核細(xì)胞為來源,利用EGM-2MV培養(yǎng)基在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)并擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞;應(yīng)用細(xì)胞功能試驗(yàn),細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞;建立裸鼠非霍奇金淋巴瘤皮下移植瘤模型,尾靜脈給予GFP標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞,了解內(nèi)皮祖細(xì)胞在淋巴瘤血管中募集及其定位特征;

2、采用共培養(yǎng)技術(shù),了解內(nèi)皮祖細(xì)胞與成熟內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后血管形成能力的變化。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞后1周,細(xì)胞間可出現(xiàn)以克隆形式生長的不規(guī)則細(xì)胞,培養(yǎng)第3周末細(xì)胞克隆擴(kuò)大融合,呈現(xiàn)典型的鋪路石樣表現(xiàn);提純分類該類細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其具有攝取ac-LDL及與UEA-1結(jié)合的內(nèi)皮細(xì)胞能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞可逐漸獲得內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志,干細(xì)胞表面標(biāo)志逐漸消失;與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相比,該細(xì)胞具有更強(qiáng)的成管能力,鑒定該類

3、細(xì)胞為原代內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)尾靜脈外源性注射入裸鼠體內(nèi)后,在注射后第3天,10天時(shí)間點(diǎn)觀察裸鼠非霍奇金淋巴瘤移植瘤瘤體切片內(nèi)均可見GFP標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞,定位于血管周圍,且注射后第10天裸鼠瘤體內(nèi)血管形成更多;體外共培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞及成熟內(nèi)皮細(xì)胞,較單純成熟內(nèi)皮細(xì)胞及單純內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)顯示出更強(qiáng)的成管及遷移能力。
　　結(jié)論：
　　1.利用臍血單個(gè)核細(xì)胞為來源,可以成功培養(yǎng)出原代內(nèi)皮祖細(xì)胞;
　　2.內(nèi)皮祖細(xì)胞可被募

4、集至淋巴瘤移植瘤瘤體內(nèi),參與其血管形成;同時(shí)隨時(shí)間增加,內(nèi)皮祖細(xì)胞可以促進(jìn)淋巴瘤的血管形成;
　　3.內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)淋巴瘤血管形成可能是與成熟內(nèi)皮細(xì)胞共同作用下促進(jìn)細(xì)胞的遷移及成管能力來實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分：淋巴瘤微環(huán)境激活HDAC7對內(nèi)皮祖細(xì)胞血管形成能力的影響
　　目的：研究淋巴瘤微環(huán)境通過HDAC7蛋白對內(nèi)皮祖細(xì)胞血管形成能力的影響。
　　方法：以內(nèi)皮祖細(xì)胞為研究對象,利用非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞上清為干預(yù)因素

5、,應(yīng)用成管實(shí)驗(yàn)研究淋巴瘤細(xì)胞上清對內(nèi)皮祖細(xì)胞血管形成能力的影響;同時(shí)應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測淋巴瘤細(xì)胞上清對內(nèi)皮祖細(xì)胞中HDAC7蛋白表達(dá)的作用;利用siRNA技術(shù)沉默內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)HDAC7基因,研究沉默HDAC7基因后對內(nèi)皮祖細(xì)胞成管及遷移能力的影響。
　　結(jié)果：淋巴瘤細(xì)胞上清及VEGF細(xì)胞因子干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞后,可促進(jìn)其成管能力,同時(shí)激活HDAC7蛋白的磷酸化。沉默內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)的HDAC7基因后,內(nèi)皮祖細(xì)胞的成管能力減弱,單位時(shí)間內(nèi)

6、遷移能力下降。
　　結(jié)論：淋巴瘤微環(huán)境可能通過激活HDAC7蛋白促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的成管及遷移能力,從而增進(jìn)細(xì)胞的血管形成能力。
　　第三部分：VEGF-PKD1-HDAC7信號通路調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制研究
　　目的：研究VEGF如何調(diào)控HDAC7信號,同時(shí)明確其可能激活的信號通路。
　　方法：應(yīng)用免疫印跡技術(shù)了解VEGF刺激下HDAC7及其上游蛋白的激活情況,免疫熒光技術(shù)檢測VEGF作用下HDAC7的細(xì)胞內(nèi)定位;同

7、時(shí)應(yīng)用VEGF下游激酶的特異性抑制劑分別抑制VEGF下游激酶的表達(dá),免疫印跡技術(shù)及免疫熒光技術(shù)分別了解激酶作用下HDAC7的激活情況及細(xì)胞核漿轉(zhuǎn)位情況的變化,從而了解VEGF是通過哪一條信號途徑調(diào)節(jié)HDAC7的表達(dá)或定位變化。
　　結(jié)果：VEGF作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞后,HDAC7出現(xiàn)磷酸化,其磷酸化在30-60min達(dá)到最大程度,隨后隨時(shí)間延長而減弱,同時(shí)VEGF還促進(jìn)HDAC7的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng),VEGF作用2h后HDAC7出核量達(dá)到最