PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長速度關聯(lián)分析及對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響.pdf

1、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)家族是眾多原癌基因中極重要的一員，參與多種信號通路，調節(jié)細胞的主要生理功能。由PI3K與AKT組成的PI3K-AKT信號通路在細胞的增殖以及凋亡等過程中發(fā)揮至關重要的作用。本試驗采用PCR產物直接測序法尋找PIK3CA和AKT3基因的遺傳變異，應用PCR-RFLP技術對歐洲大白兔、伊拉兔D系和福建黑兔3個肉兔品種共711個個體進行基因型分析，探討家兔PIK3C

2、A和AKT3基因的多態(tài)性及其與家兔生長速度的相關性。隨后選取出生后1d的新西蘭仔兔為實驗材料，進行分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細胞(Skeletal muscle satellite cells，SCs)，并采用siRNA介導的PIK3CA和AKT3基因進行基因的沉默表達，研究其在家兔SCs增殖過程中發(fā)揮的作用。主要結果如下:
　　1.通過PCR產物直接測序，在PIK3CA基因序列上共找到6個SNPs位點，分別為: g.12178A＞

3、G、g.12388C＞T、 g.12605T＞C、g.12711C＞G、 c.3068A＞G和c.3377G＞C。其中c.3068A＞G為同義突變，位于外顯子20。對該位點采用PCR-RFLP的技術進行基因分型并進行關聯(lián)性分析。結果發(fā)現(xiàn):c.3068A＞G位點在歐洲大白和福建黑兔群體中，AG基因型個體的35、56和70日齡體重均顯著高于GG基因型個體(P＜0.05)，在伊拉兔D系群體中AG基因型個體35-70日齡的平均日增重則極顯著高于

4、GG基因型個體（P＜0.01）。
　　2.AKT3基因序列上檢測到2個SNPs位點，分別為:c.1213A＞C和g.258389T＞C。其中c.1213A＞C為同義突變，位于外顯子10。關聯(lián)性分析表明:c.1213A＞C位點在歐洲大白兔群體中，AA基因型個體的35、56和70日齡體重均顯著高于CC基因型個體（P＜0.05）。
　　3.針對PIK3CA和AKT3基因，分別采用三對特異的siRNA序列轉染SCs，然后qRT-PC

5、R法檢測在濃度分別為25nM、50nM、75nM和100nM情況下，轉染組和對照組中PIK3CA和AKT3基因mRNA的相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)使用50nM的si-PIK3CA-003和50nM的si-AKT3-001對細胞內靶基因的mRNA表達水平均有理想的下調作用，對靶基因的抑制效率分別為85.16％和83.93％。
　　4.對處于對數生長期的細胞轉染si-PIK3CA-003或si-AKT3-00148h后，分別對靶基因和上下游

6、基因PTEN和FoxO1進行qRT-PCR反應。結果表明:在轉染si-PIK3CA-003后，PIK3CA和AKT3基因的相對表達量均顯著下調， PTEN和FoxO1基因的表達量均顯著上調;當轉染了si-AKT3-001后， PTEN和FoxO1基因表達量均顯著上調。表明PTEN、FoxO1基因與PIK3CA、AKT3基因的相對表達量呈負相關。
　　5.選取處于對數期的SCs進行轉染實驗，采用CCK-8試劑盒通過酶標儀檢測其在轉染

7、si-PIK3CA-003或si-AKT3-001后細胞增殖能力的改變。結果發(fā)現(xiàn):轉染實驗組OD值顯著低于空白對照組(P＜0.05)，說明通過轉染實驗下調PIK3CA和AKT3基因表達后，細胞增殖能力均有顯著的下降。說明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖過程中起到重要的作用，能夠正向調控肌細胞的增殖。
　　家兔PIK3CA和AKT3基因CDS區(qū)的SNPs與生長速度相關，PIK3CA和AKT3基因可作為影響家兔生長速度的重要候選基