內(nèi)源性硫化氫對巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)過程中鈣化和BMP表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的:異位鈣化即非骨組織發(fā)生礦物質(zhì)沉積,主要是鈣鹽沉積,血管組織鈣化是其中的一種,分為中膜鈣化和內(nèi)膜鈣化。后者與動脈粥樣硬化密切相關(guān),早期參與的細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。硫化氫在心血管系統(tǒng)中具有重要的生理與病理作用,本實驗擬利用L-半胱氨酸作為硫化氫的內(nèi)源性供體,在β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate,β-GP)和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,

2、oxLDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞鈣鹽沉積的細(xì)胞模型上研究內(nèi)源性硫化氫對巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)過程中鈣化和骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)表達(dá)的影響及其機制,為進(jìn)一步探討其對內(nèi)膜鈣化的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　實驗一鈣化細(xì)胞模型的建立
　　小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用5mmol/L的β-GP和40mg/mL的oxLDL孵育3天,von Kossa染色形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞鈣鹽沉積,原

3、子吸收分光光度法測定細(xì)胞鈣含量。
　　實驗二不同濃度L-半胱氨酸對細(xì)胞鈣化和BMP表達(dá)的影響
　　1、正常對照組:含10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　2、鈣化組:40mg/mL oxLDL和5mmol/L的β-GP培養(yǎng)基孵育細(xì)胞。
　　3、不同濃度L-半胱氨酸組(50,100,200mmol/L):鈣化組細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入相應(yīng)濃度L-半胱氨酸(50,100,200mmol/L),孵育細(xì)胞4天。

4、r>　　實驗三 L-半胱氨酸處理不同時間對細(xì)胞鈣化和BMP表達(dá)的影響
　　1、正常對照組:含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　2、不同時間處理組(0,2,4,6d):最佳濃度 L-半胱氨酸處理鈣化組細(xì)胞不同時間(0,2,4,6d)。
　　實驗四 PPG對細(xì)胞鈣化和BMP表達(dá)的影響
　　1、正常對照組:10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　2、不同濃度PPG處理鈣化細(xì)胞組(0,2,4,8m

5、mol/L):不同濃度PPG孵育鈣化細(xì)胞組12h。
　　結(jié)果:
　　鈣化組細(xì)胞von Kossa染色見細(xì)胞內(nèi)有大量褐色顆粒聚集,鈣含量高于對照組2.1倍(P<0.01), BMP mRNA和蛋白表達(dá)分別是正常對照組的1.6倍和1.8倍(P<0.05),L-半胱氨酸組較鈣化組細(xì)胞,細(xì)胞von Kossa染色褐色顆粒減少,鈣含量降低,BMP蛋白和mRNA表達(dá)也呈下降趨勢,特別是50mmol/L的L-半胱氨酸組作用最顯著von K

6、ossa染色幾乎未見褐色顆粒,其BMP mRNA和蛋白表達(dá)低于鈣化組1.6倍和2.2倍(P<0.05),接近正常對照組。PPG組結(jié)果相反,即隨著PPG濃度的升高,細(xì)胞鈣化程度加重,von Kossa染色可見大量褐色顆粒,BMP mRNA和蛋白的表達(dá)也隨濃度升高而增加。
　　結(jié)論:
　　1、內(nèi)源性硫化氫可以減少巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)過程中的細(xì)胞內(nèi)鈣含量和鈣沉積;
　　2、內(nèi)源性硫化氫可以下調(diào)巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)過程中BMP的表達(dá)水