脫細(xì)胞牛心包上種植混合細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分牛心包組織工程心臟瓣膜支架的制備 目的:心血管組織工程為構(gòu)建理想的心臟瓣膜替代物提供了新思路，支架材料是構(gòu)建組織工程心臟瓣膜(tissue—engineered heart valves．TEHVs)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)對比去污劑～酶消化法(detergent and enzvme extraction，DEE)、胰蛋白酶消化法(trypsin，TS)和去氧膽酸鈉法(Triton—X100 and sodium—deoxych

2、olate，TSD)去除新鮮牛心包組織上細(xì)胞的效果和保護(hù)基質(zhì)的能力，為TEHVs構(gòu)建提供較滿意的支架材料。 方法:應(yīng)用三種方法處理新鮮牛心包組織，用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡觀察脫細(xì)胞效果和膠原纖維、彈力纖維改變；熱皺縮實(shí)驗(yàn)、拉力測試觀察基質(zhì)的物理性能變化；DNA抽提比較脫細(xì)胞前后細(xì)胞數(shù)量差異。 結(jié)果:形態(tài)學(xué)觀察顯示：三種方法均能完全去除細(xì)胞，但是與去污劑一酶消化法比較，其它兩種方法對基質(zhì)破壞明顯。DEE、TS、TSD和對照

3、組(n=10)熱皺縮溫度分別為64.50℃±2.13℃、64.12℃±2.42℃、65.36℃±1.70℃、66.26℃±2.01℃，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DEE組與對照組在彈性模量、拉伸強(qiáng)度、最大變形量、最大載荷、拉伸率五項(xiàng)指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而TS、TSD兩組與對照組在五項(xiàng)指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DNA抽提DEE組0.054gg/mg±0.007μg/g；TS組0.56gg/mg±0.0

4、10μg/mg；TSD組0.051μg/mg±0.012μg/mg；對照組0.602μg/mg±0.102μg/mg。DEE、TS、TSD組分別與對照組比較，均有顯著性差異。 結(jié)論:去污劑一酶消化法脫細(xì)胞效果好，且有良好的保護(hù)基質(zhì)能力。 第二部分心瓣膜組織工程中種子細(xì)胞原代聯(lián)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討體外原代聯(lián)合培養(yǎng)、擴(kuò)增，鑒定同一來源人血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的方法，為TEHVs構(gòu)建提供理想的種子

5、細(xì)胞。 方法:無菌條件下取冠狀動脈旁路移植術(shù)中大隱靜脈3cm～8cm，組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)混合血管細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)、擴(kuò)增內(nèi)皮細(xì)胞。倒置顯微鏡、免疫組化方法對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果:倒置顯微鏡結(jié)果顯示：原代細(xì)胞及經(jīng)傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，呈現(xiàn)內(nèi)皮樣細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞混合生長的特征。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測示內(nèi)皮細(xì)胞VIII因子、平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白、成纖維細(xì)胞FibrOnectin相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)。

6、細(xì)胞經(jīng)3～4次傳代，細(xì)胞數(shù)量可增殖達(dá)到8～10×10<'6>。 結(jié)論:組織塊法原代培養(yǎng)可獲得內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，三種細(xì)胞經(jīng)體外聯(lián)合培養(yǎng)、傳代，數(shù)量可達(dá)到TEHVs種子細(xì)胞要求。第三部分去細(xì)胞牛心包上動態(tài)混合種植血管混合細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜目的:探討在去細(xì)胞牛心包上種植血管混合細(xì)胞構(gòu)建組TEHVs的方法與效果。 方法:將體外原代培養(yǎng)的人大隱靜脈血管混合細(xì)胞動態(tài)種植在脫細(xì)胞牛心包支架材料上，構(gòu)建TEHVs，

7、動態(tài)觀察種子細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)變化和脫細(xì)胞牛心包表面超微結(jié)構(gòu)變化；收集瓣膜構(gòu)建各期培養(yǎng)液，應(yīng)用發(fā)色底物法測定內(nèi)皮細(xì)胞分泌的t-PA和PAI-1的活性。 結(jié)果:種子細(xì)胞逐漸全層覆蓋脫細(xì)胞牛心包表面，而后分成數(shù)層并浸潤至支架材料內(nèi)部生長；免疫組化顯示：內(nèi)皮細(xì)胞VⅢ因子、平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白、成纖維細(xì)胞Fibronectin相關(guān)抗原呈陽性表達(dá)；種子細(xì)胞能分泌纖溶活性物質(zhì)t-PA和PAI-1；種植種子細(xì)胞后脫細(xì)胞牛心包表面為扁平

8、、片狀、大小欠規(guī)則的細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞漸重疊、分層，細(xì)胞表面有少量絨毛和纖細(xì)的纖維結(jié)構(gòu)。 結(jié)論:混合細(xì)胞種植后附著滿意，與脫細(xì)胞牛心包生物相容性滿意，生長狀況好，具有內(nèi)皮功能。 目的:將血管混合細(xì)胞體外動態(tài)種植于脫細(xì)胞牛心包構(gòu)建的TEHVs移植入裸鼠體內(nèi)，觀察其生物學(xué)特征變化。 方法:將體外動態(tài)構(gòu)建的TEHVs移植入裸鼠體內(nèi)，15d、30d時(shí)處死，觀察組織、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，種子細(xì)胞的生長行為和生物學(xué)特征變化，種子

9、細(xì)胞與支架材料的黏附性，TEHVs的生物相容性等技術(shù)參數(shù)。 結(jié)果:組織學(xué)觀察見：細(xì)胞數(shù)量、分層數(shù)較移植前增多，并有大量細(xì)胞浸潤入TEHVs深層組織內(nèi)；免疫組化顯示：TEHVs上細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞VⅢ因子、平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白、成纖維細(xì)胞Fibronectin相關(guān)抗原呈陽性表達(dá)；掃描電鏡見：裸鼠體內(nèi)移植后細(xì)胞數(shù)量較移植前增多，細(xì)胞表面和細(xì)胞之間的網(wǎng)狀膠原結(jié)構(gòu)較埋置前增多明顯；透射電鏡可見：W-P小體、質(zhì)膜小泡、密斑、密體、微絲等特征