胚胎發(fā)育速度及解凍后不同體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響.pdf

1、背景：胚胎冷凍保存就是使用特殊的保護(hù)劑和降溫措施對(duì)早期動(dòng)物胚胎進(jìn)行冷凍，使其在-196℃的液氮中停止細(xì)胞的生化活動(dòng)，降低新陳代謝，在復(fù)蘇后又能恢復(fù)代謝能力，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存胚胎的一種生物技術(shù)。無(wú)論在新鮮周期還是凍融周期中，選擇發(fā)育潛能較好的胚胎優(yōu)先移植，提高種植率并降低多胎率仍是各生殖中心的目標(biāo)之一，與此同時(shí)因超促排卵治療所帶來(lái)的多余胚胎，同樣也受到越來(lái)越多世界各地生殖醫(yī)學(xué)專家關(guān)注[1，2]。1983年Trounson and Mohr

2、[3]首次將胚胎冷凍-解凍技術(shù)運(yùn)用于人類胚胎，并獲得臨床妊娠，隨后冷凍技術(shù)不斷革新，如今已普遍應(yīng)用于世界各地。在體外授精-胚胎移植(in vitro fertilizationand embryo transfer，IVF-ET)對(duì)不孕癥的治療過(guò)程中大約有40％～60％[4]的患者行新鮮胚胎移植后仍有多余良好胚胎，使用胚胎冷凍技術(shù)可以合理限制移植胚胎數(shù)，降低多胎妊娠的發(fā)生[5，6]，還可為移植失敗、流產(chǎn)患者提供再次移植的機(jī)會(huì)，提高IVF

3、的累計(jì)妊娠率，減少了患者因反復(fù)控制性超促排卵產(chǎn)生的痛苦及經(jīng)濟(jì)壓力。此外對(duì)因超促排卵所致中、重度卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarianhyperstimulation syndrome，OHSS)風(fēng)險(xiǎn)而不宜行新鮮移植的患者，將其胚胎冷凍保存，擇期移植可有效的提高周期累計(jì)妊娠率。影響凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)能否獲得妊娠的因素有很多，就胚胎而言包括冷凍前胚胎發(fā)育速度和形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)[7]、復(fù)蘇

4、后胚胎損傷程度[8]以及卵裂球復(fù)蘇情況[9]。本研究旨在探討胚胎發(fā)育速度和冷凍----解凍后胚胎不同體外培養(yǎng)時(shí)間與FET妊娠結(jié)局的關(guān)系，從而更好的為FET周期挑選較高植入潛能和發(fā)育潛能的胚胎提供參考，以提高凍融胚胎移植周期妊娠率。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：卵裂期胚胎發(fā)育速度及冷凍解凍后不同體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FET助孕結(jié)局的影響。
　　 目的：探討卵裂期胚胎發(fā)育速度及冷凍解凍后不同體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FET助孕結(jié)局的影響

5、。
　　 方法：⑴研究對(duì)象回顧性研究2012年1月至12月南方醫(yī)院生殖中心行FET助孕治療患者共661個(gè)移植周期，納入標(biāo)準(zhǔn):①符合IVF/卵泡漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的一般標(biāo)準(zhǔn);②取卵周期采用標(biāo)準(zhǔn)黃體中期長(zhǎng)方案、拮抗劑方案者;③新鮮周期移植失敗或者取消移植，2-3個(gè)月內(nèi)行自然周期、自然周期+人絨毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotro

6、pin，HCG)、促排卵周期、無(wú)垂體降調(diào)節(jié)的激素替代周期凍融胚胎移植;④FET周期移植2-3個(gè)卵裂期胚胎。IVF指征為輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、排卵障礙等;ICSI指征為男方嚴(yán)重少弱精子癥、阻塞性無(wú)精子癥、逆行射精、前次IVF受精失敗;ICSI精子來(lái)源于射精、附睪抽吸、睪丸活檢。排除標(biāo)準(zhǔn):①新鮮周期行coasting方案;②FET周期行兩步移植以及解凍胚胎行囊胚培養(yǎng)后移植周期;③異常受精者;④子宮腺肌癥、粘膜下肌瘤、宮腔粘連、宮腔積液

7、、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜增生以及盆腔結(jié)核等明確影響子宮內(nèi)環(huán)境因素的患者;⑤凍融前后行輔助孵化者。⑵FET妊娠結(jié)局相關(guān)性指標(biāo)的確定方法運(yùn)用雙變量相關(guān)分析。⑶分組方法根據(jù)冷凍前D3胚胎卵裂球數(shù)將凍融移植周期胚胎分為三組，A組:均為6～8細(xì)胞;B組:均為＜6細(xì)胞;C組:均為＞8細(xì)胞，另移植多個(gè)胚胎的卵裂球數(shù)分組不一致的胚胎移植周期不納入本部分研究。再根據(jù)胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間分組，分為D組（解凍后體外培養(yǎng)2～4h，第3天移植）和E組（解凍后體

8、外培養(yǎng)18～24小時(shí)，第4天移植）。其中，根據(jù)解凍后體外培養(yǎng)2～4h內(nèi)胚胎卵裂球復(fù)蘇情況將D組分為D1（即:所移植的所有胚胎卵裂球均存活未丟失）和D2（即:所移植的所有胚胎至少有一個(gè)卵裂球丟失但丟失比例＜50％）。根據(jù)解凍后體外培養(yǎng)18～24小時(shí)內(nèi)胚胎恢復(fù)有絲分裂的情況將E組分為E1（即:所有胚胎均恢復(fù)有絲分裂的FET周期組）和E2（即:部分胚胎恢復(fù)有絲分裂的FET周期組）。⑷FET移植原因新鮮周期移植失敗或者取消新鮮周期移植。⑸冷凍周

9、期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方式采用自然周期、促排卵周期(HMG)、無(wú)垂體降調(diào)節(jié)的激素替代周期和自然周期+HCG。⑹根據(jù)男方精液處理后的質(zhì)量選擇IVF/ICSI受精，原核的觀察在受精后的16-18小時(shí)進(jìn)行，D2胚胎的觀察在受精后的44±1小時(shí)進(jìn)行，D3胚胎的觀察在受精后的68±1小時(shí)進(jìn)行。取卵后72h根據(jù)患者年齡、既往移植情況及有無(wú)OHSS癥狀選擇該患者所有胚胎中最好的1-3枚進(jìn)行移植，剩余胚胎在征得患者知情同意后，根據(jù)我中心的凍存標(biāo)準(zhǔn)予以冷凍保存。

10、胚胎冷凍與復(fù)蘇、黃體支持及妊娠診斷方法均按照本中心常規(guī)進(jìn)行操作。⑺統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)包對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）或率(％)來(lái)表示。劑量資料滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者one-way ANOVA，不滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，則采用非參數(shù)的Kruskal-WallisH檢驗(yàn);率的比較用卡方檢驗(yàn);雙變量相關(guān)分析中，對(duì)于正態(tài)分布的雙變量資料，采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析;非正態(tài)分布的

11、雙變量資料，用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，多變量相關(guān)分析采用二分類logistic回歸。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在表中直接以P值表示，P≥0.05為無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在表中表示為NS。
　　 結(jié)果：①本研究共661個(gè)FET周期，解凍1634枚胚胎，復(fù)蘇存活1615枚胚胎，復(fù)蘇率為98.8％，移植1511枚胚胎，著床423枚，胚胎著床率為27.99％。661個(gè)FET周期中，281個(gè)周期獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為42.

12、5％。FET妊娠結(jié)局與助孕方案、受精方式、FET移植原因以及FET周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案無(wú)相關(guān)性(P＞0.05);與冷凍胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間成正相關(guān)(r=0.08，p=0.04)，但相關(guān)性不大;與新鮮周期胚胎發(fā)育的速度呈正相關(guān)(r=0.113，P=0.009)。②A、B、C三組間患者年齡、不孕年限、新鮮周期促排方案構(gòu)成比、新鮮周期授精方式構(gòu)成比、FET周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案構(gòu)成比、子宮內(nèi)膜厚度、每周期移植胚胎數(shù)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.

13、05)。三組間胚胎復(fù)蘇率(P=0.007)、臨床妊娠率(P=0.003)、以及胚胎種植率(P=0.007)比較具有顯著性差異。三組間解凍后100％卵裂球存活率、多胎率、自然流產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。將解凍后卵裂100％存活周期與非100％存活周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)胚胎種植率、臨床妊娠率以及自然流產(chǎn)率之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。③通過(guò)校正D組和E組患者新鮮周期促排卵方案構(gòu)成比、受精方式構(gòu)成比、FET子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備

14、方案構(gòu)成比、子宮內(nèi)膜的厚度和每移植周期胚胎數(shù)等混雜因素對(duì)助孕結(jié)局相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)帶來(lái)的影響，行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn)D組與E組比較在胚胎種植率(95％CI0.745;1.152，P=0.493)、臨床妊娠率(95％CI0.908;1.408，P=0.272)、自然流產(chǎn)率(95％CI0.538;1.378，P=0.533)以及多胎妊娠率(95％CI0.861;1.727，P=0.265)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④D1、D2組比較胚胎種植率（

15、29.60％VS.27.60％, P＞0.05）、臨床妊娠率（44.40％VS.46.90％, P＞0.05）、自然流產(chǎn)率（12.50％VS.17.40％, P＞0.05）多胎妊娠率（39.70％VS.39.10％，P＞0.05）之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑤E1、E2組間自然流產(chǎn)率相比無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，胚胎種植率（30.40％VS.15.70％, P=0.000）、臨床妊娠率（45.50％VS.25.00％, P=0.001）、

16、多胎妊娠率（35.30％VS.9.50％, P=0.020）相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：⑴冷凍胚胎解凍移植獲得妊娠的關(guān)鍵在于冷凍前胚胎發(fā)育速度，6-8細(xì)胞和＞8細(xì)胞的胚胎在FET周期均能獲得較理想的種植率和妊娠率，但6-8細(xì)胞的胚胎優(yōu)于＞8細(xì)胞的胚胎，與存活胚胎卵裂球丟失與否無(wú)明顯相關(guān)。⑵解凍后胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間不影響FET周期助孕結(jié)局，體外培養(yǎng)環(huán)境中胚胎發(fā)育不良，不能說(shuō)明其在體內(nèi)同樣發(fā)育不良。⑶解凍后延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，

17、移植胚胎全部恢復(fù)有絲分裂組能獲得較好的胚胎種植率、臨床妊娠率，但其發(fā)生多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)相應(yīng)增高。因此可能導(dǎo)致妊娠后期產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)生率增加。
　　 第二部分：新鮮周期囊胚形成時(shí)間及凍融周期移植個(gè)數(shù)對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響。
　　 目的：探討新鮮周期囊胚形成時(shí)間及凍融周期移植個(gè)數(shù)對(duì)FET周期妊娠結(jié)局的影響，從而為臨床工作提供參考。
　　 方法：⑴納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡＜40歲患者;②在我中心首次行囊胚-FET，移植囊胚1-

18、2個(gè);③新鮮周期移植失敗或者取消移植，至少間隔2個(gè)月內(nèi)再行FET;⑵排除標(biāo)準(zhǔn)①新鮮周期行coasting方案;②FET周期所移植囊胚在新鮮周期培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)育速度不一致;③異常授精者;④存在影響子宮內(nèi)膜環(huán)境因素的患者;⑤冷凍前為正在孵出或者已經(jīng)完全孵出的囊胚。⑶分組標(biāo)準(zhǔn)按照新鮮周期囊胚形成速度分三組;A組為冷凍第五天形成的囊胚;B組為冷凍第六天形成的囊胚;再根據(jù)每移植周期相同囊胚形成時(shí)間不同移植個(gè)數(shù)將A組分為A1組（單囊胚移植）和A2組（

19、雙囊胚移植）;將B組分為B1組（單囊胚移植）和B2組（雙囊胚移植）;⑷控制性超促排卵、取卵，精液收集，優(yōu)化處理以及體外授精方式的選擇、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。⑸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)包對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)或率(％)來(lái)表示。計(jì)量資料滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者one-way ANOVA，不滿足方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，則采用非參數(shù)的Kruskal-WallisH檢驗(yàn);率的比較用卡方

20、檢驗(yàn);雙變量相關(guān)分析中，對(duì)于正態(tài)分布的雙變量資料，采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析:非正態(tài)分布的雙變量資料，用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，多變量相關(guān)分析采用二分類logistic回歸。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在表中直接以P值表示，P≥0.05為無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在表中表示為NS。
　　 結(jié)果：①本研究共163個(gè)移植周期，平均年齡（30.76±4.50）歲，不孕年限（4.65±3.12）年，共解凍胚胎292枚，復(fù)蘇后存

21、活286枚，本研究的解凍復(fù)蘇率97.95％，移植胚胎共279枚，種植胚胎數(shù)為69枚，胚胎種植率為24.73％，共移植163個(gè)周期，妊娠56個(gè)周期，妊娠率為34.36％，在囊胚冷凍移植周期中，A、B兩組患者胚胎種植率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.042)，且A組＞B組，而臨床妊娠率、自然流產(chǎn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。②A1、A2兩組患者年齡、不孕年限、新鮮周期超促排方案構(gòu)成比、取卵后授精方式構(gòu)成比、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式、子宮內(nèi)膜厚

22、度、囊胚冷凍復(fù)蘇率、胚胎種植率、臨床妊娠率以及自然流產(chǎn)率兩組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。③B1、B2兩組患者年齡以及不孕年限差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.001)，且均為B1組＞B2組，其余新鮮周期超促排方案構(gòu)成比、取卵后授精方式構(gòu)成比、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式、子宮內(nèi)膜厚度、囊胚冷凍復(fù)蘇率、胚胎種植率、臨床妊娠率以及自然流產(chǎn)率兩組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通過(guò)校正B1組、B2組患者年齡及不孕年限等

23、混雜因素對(duì)妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)帶來(lái)的影響，行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn)兩組比較在臨床妊娠率(95％CI0.152;0.966，P=0.042)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而自然流產(chǎn)率(95％CI0.159;15.205，P=0.705)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④A1、B1兩組患者年齡、不孕年限、新鮮周期超促排方案構(gòu)成比、取卵后授精方式構(gòu)成比、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式、子宮內(nèi)膜厚度、囊胚冷凍復(fù)蘇率、胚胎種植率、臨床妊娠率、以及自然流產(chǎn)率兩組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

24、異(P＞0.05)。然而兩組間胚胎種植率以及臨床妊娠率雖然比較無(wú)顯著差異，但A1明顯大于B1。⑤A2、B2兩組患者年齡、不孕年限、取卵后授精方式構(gòu)成比、新鮮周期超促排方案構(gòu)成比、子宮內(nèi)膜厚度比較組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.042);兩組囊胚冷凍復(fù)蘇率、臨床妊娠率、以及自然流產(chǎn)率兩組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而胚胎種植率兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.042)，且A

25、2組＞B2組。通過(guò)校正A2、B2兩組患者FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案構(gòu)成比這一混雜因素對(duì)囊胚-FET妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)帶來(lái)的影響，行l(wèi)ogistic回歸分析比較兩組臨床妊娠(95％CI0.192;0.976，P=0.020)組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、自然流產(chǎn)率(95％CI0.090;1.802，P=0.234)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：⑴D5、D6形成的囊胚冷凍后-復(fù)蘇后，胚胎存活率無(wú)顯著差異，說(shuō)明不同發(fā)育階段的3-4期優(yōu)質(zhì)囊胚經(jīng)過(guò)玻璃化