驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌中表達的臨床意義及功能研究.pdf

1、乳腺癌是嚴重威脅世界女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，據(jù)統(tǒng)計，2008年，美國40，000女性死于乳腺癌。在亞洲和許多發(fā)展中國家，女性乳腺癌的發(fā)病率逐年增加。乳腺癌已經(jīng)成為東南亞女性死亡的主要原因，乳腺癌是年齡在40～79歲之間的女性死亡的最主要原因。在東亞女性中，已經(jīng)成為僅次于胃癌的第二大惡性腫瘤。在我國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，并且上升的速度已經(jīng)超過了世界平均上升速度。在中國的部分城市如北京、上海等地方，乳腺癌已經(jīng)

2、成為女性死亡率最高的疾病，而乳腺癌的發(fā)病原因至今仍不十分明確。20世紀90年代人們發(fā)現(xiàn)了微管驅(qū)動蛋白，這些蛋白在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分裂和雙極紡錘體形成中有極其重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)，某些驅(qū)動蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。驅(qū)動蛋白-13家族中Kif2c/MCAK與腫瘤的關(guān)系已有報道，但驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及與預后的關(guān)系至今尚無研究報道。本課題分為三部分，從不同方面分別對Kif2a與乳腺癌的關(guān)系進行研究：
　　 第一部

3、分驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌中表達的臨床意義
　　 研究目的：
　　 通過檢測驅(qū)動蛋白Kif2a及其mRNA在乳腺癌和癌旁組織中的表達情況，探討Kif2a與乳腺癌臨床病理特點的關(guān)系，為探索Kif2a與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系提供參考。
　　 研究方法：
　　 1.病例資料收集
　　 以1997和2009年間在山東大學齊魯醫(yī)院乳腺外科接受乳腺癌根治術(shù)或改良根治術(shù)的116例原發(fā)性乳腺癌病人作為研究

4、對象(1997年60例，2009年56例)。本組116例病人均為女性，發(fā)病年齡20～65歲，中位年齡45歲，所有病例術(shù)前均未接受放射治療、化療以及內(nèi)分泌治療。1997年手術(shù)的60例病例隨訪時間超過10年。
　　 2.免疫組化染色
　　 對116例乳腺癌和癌旁組織進行Kif2a常規(guī)免疫組化染色。結(jié)果分析采用改良的Harvey評分標準。
　　 3.Real time RT-PCR檢測
　　 在留取乳腺癌和癌旁

5、組織做石蠟包埋的同時，分別各取部分新鮮的癌和癌旁組織迅速放入-196℃液氮中保存，統(tǒng)一提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴增，檢測mRNA表達情況。
　　 4.統(tǒng)計學分析
　　 用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗。用log-rank檢驗分析Kif2a表達與生存時間的關(guān)系，P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.Kif2a在原發(fā)乳腺癌組

6、織中表達高于癌旁組織
　　 驅(qū)動蛋白Kif2a免疫組化染色定位于腫瘤細胞漿和細胞核中，68.2％的病例中乳腺癌細胞Kif2a表達高于癌旁組織上皮細胞，評分分別為7.0517±0.74419和6.2931±0.97817，原發(fā)癌組織與癌旁組織表達水平在統(tǒng)計學上有顯著差異(P<0.05)。
　　 2.乳腺癌組織中Kif2a的mRNA表達高于癌旁組織
　　 檢測4對原發(fā)癌和癌旁組織中Kif2a的mRNA，同時檢測癌和癌

7、旁組織蛋白水平的表達，結(jié)果顯示：原發(fā)癌組織中Kif2a的mRNA表達水平高于癌旁組織，與免疫組化檢測的原發(fā)癌和癌旁組織Kif2a蛋白表達結(jié)果一致。
　　 3.Kif2a在乳腺癌組織中過表達與臨床病理特點的相關(guān)性
　　 本組116例病人中，原發(fā)癌組織中Kif2a表達水平與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a的表達評分分別為：7.3043±0.6486和6.6809±0.7255，

8、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a表達高于腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。但是，Kif2a的表達水平與病人的年齡、腫瘤大小、病理學分期無關(guān)(P>0.05)。
　　 4.乳腺癌組織中Kif2a的表達水平與病人生存率相關(guān)
　　 本組116例乳腺癌病人中，60例病人的隨訪時間超過10年。隨訪結(jié)果顯示：Kif2a的表達與患者預后有關(guān)。Kif2a蛋白高表達病人的10年生存率是51.1％，低表達的生存率是93.3％，高

9、表達與低表達兩組之間的生存率有顯著差異(P<0.05)。乳腺癌伴有肝臟、肺臟或骨轉(zhuǎn)移的患者，原發(fā)癌組織中Kif2a的評分都較高。
　　 結(jié)論：
　　 1.乳腺癌組織中的Kif2a在mRNA和蛋白水平上的表達均高于相應癌旁組織中的表達。
　　 2.乳腺癌組織中Kif2a蛋白的表達與病人的年齡、病理學組織分級、腫瘤大小無關(guān)，與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a表達高于腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患

10、者。
　　 3.乳腺癌組織中Kif2a蛋白的表達與預后相關(guān)，Kif2a高表達者生存率遠低于低表達者。
　　 第二部分轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA乳腺癌MCF-7細胞惡性行為的影響
　　 研究目的：
　　 通過siRNA干擾方法，沉默乳腺癌MCF-7細胞中的Kif2a基因，檢測乳腺癌MCF-7細胞在增殖、凋亡、遷移以及侵襲能力方面的變化，探討Kif2a在乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移以及侵襲中的作用，為探索以Ki

11、f2a為新靶點的乳腺癌生物靶向治療提供參考依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA
　　 根據(jù)siRNA轉(zhuǎn)染說明進行轉(zhuǎn)染。將乳腺癌MCF-7細胞(2×105/孔)接種于6孔板中，孵育16小時后，融合率達30～50％時，將5μlKif2a的siRNA和200μlOPTI-MEM混合，然后與5μ l脂質(zhì)體lipofectamine2000和200μ l OPTI-MEM的混合物混勻，加入每個孔，

12、使每孔的Kif2a劑量為50nM/2ml，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4-6小時后，將培養(yǎng)基換成含10％胎牛血清的RPMI1640分別繼續(xù)培養(yǎng)至24小時、48小時和72小時。
　　 2.MTT法檢測細胞增殖抑制
　　 MTT法檢測乳腺癌MCF-7細胞增殖情況。將MCF-7細胞接種于平底96孔板中(1.0×103/孔)，設空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和轉(zhuǎn)染特異性Kif2a-siRNA組三組細胞，分別培養(yǎng)24小時

13、、48小時和72小時。加入MTT試劑，繼續(xù)孵育4小時，離心，棄上清，加入150μl DMSO上酶標儀比色，用570nm-620nm波長測光吸收值，計算抑制率。
　　 3.細胞遷移檢測
　　 在孔徑為8.0-μ m Transwell小室下室加入600μ l10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，上室加入2×104cells/100μ l細胞懸液。放置于5％CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃、飽和濕度環(huán)境下孵育16小時；甲醇固定10

14、分鐘；伊紅染色劑染色；200倍光鏡下，計數(shù)微孔濾膜下室面遷移的腫瘤細胞，每張膜隨機計數(shù)10個視野。取平均值作為遷移細胞數(shù)量。
　　 4.細胞侵襲檢測
　　 在Transwell小室上室的底部鋪Matrigel膠40μl，細胞穿孔時間延長至24小時。其他實驗要求和方法同遷移實驗。
　　 5.流式細胞技術(shù)檢測凋亡
　　 收集空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和轉(zhuǎn)染特異性Kif2a-siRNA組細胞，用10

15、0μl稀釋結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，加5μ lAnexinV/FITC和10μ l(10μg/ml)碘化丙啶溶液?；靹蚝笥谑覝乇芄夥跤?5min。在反應管中加400μ l稀釋結(jié)合緩沖液，過濾后上流式細胞儀分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7細胞增殖受抑制
　　 空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和Kif2a-siRNA組分別培養(yǎng)24、48和72小時，OD值分別如下，24小時：0.41

16、98±0.0616(mock)，0.4076±0.0439(nonsense-siRNA)，0.2864±0.0230(Kif2a-siRNA)，48小時：0.7287±0.1318(mock)，0.7019±0.0523(nonsense-siRNA)，0.5054±0.1011(Kif2a-siRNA)；72小時：0.7948±0.0668(mock)，0.6689±0.0951(nonsense-siRNA)，0.4745±0.0

17、849(Kif2a-siRNA)。結(jié)果顯示：24、48、72小時兩組對照組與實驗組比較，抑制率有顯著性差異，均P<0.05。但24、48和72小時空白對照和轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組間比較，無顯著性差異(P>0.05)。乳腺癌MCF-7細胞轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA后，細胞增殖生長明顯受抑制。
　　 2.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7細胞遷移能力下降
　　 用Transwell小室，檢測乳腺癌MCF-7細胞沉默Kif

18、2a后對遷移能力的影響。16小時的遷移能力實驗結(jié)果顯示：與空白對照和轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA對照組相比，敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，這與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 3.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力下降
　　 Transwell小室上室底部鋪40μ l Matrigel膠，

19、檢測沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力，侵襲實驗的侵襲時間為24小時。與空白對照和無意義序列siRNA對照組相比，敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)，這也與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 4.沉默Kif2a基因?qū)θ橄侔㎝CF-7細胞凋亡無明顯影響
　　 本研究中，我們選用AnexinV/F

20、ITC法檢測轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA后24、48和72小時的晚期細胞凋亡率，流式細胞儀分析結(jié)果為24小時：6.89％±3.48％(mock)，6.91％±3.60％(Kif2a-siRNA)；48小時：9.51％±3.14％(mock)，16.65％±5.5212％(Kif2a-siRNA)：72小時：9.32％±5.34％(mock)，13.88％±5.65％(Kif2a-siRNA)。轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA的乳腺癌細胞凋亡率與

21、對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)Kif2a-siRNA轉(zhuǎn)染對乳腺癌細胞的凋亡有影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力明顯降低。
　　 2.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力明顯降低。與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達與患者有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 3.沉默Kif2a基因后對

22、乳腺癌MCF-7細胞的凋亡無明顯影響。
　　 第三部分驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表達以及與預后的關(guān)系
　　 研究目的：
　　 通過同時檢測Kif2a和癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(CEACAM1)在乳腺癌和癌旁組織中的表達，探討Kif2a與CEACAM1表達的相關(guān)性，明確驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌中的作用及與預后的關(guān)系。
　　 研究方

23、法：
　　 選取隨訪資料完整的60例乳腺癌病人為研究對象，用免疫組化方法檢測60例乳腺癌原發(fā)腫瘤及癌旁組織中Kif2a和CEACAM1的表達。統(tǒng)計分析與生存率的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌組織中的表達高于相應癌旁組織中的表達免疫組織化學方法檢測60例乳腺癌樣本及相應的癌旁組織。結(jié)果顯示，57％(34/60)病例中癌組織Kif2a表達高于癌旁組織，癌旁組織Kif2a表達明顯低于癌組

24、織，原發(fā)乳腺癌組織與癌旁組織中Kif2a表達有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.CEACAM1在乳腺癌組織中的表達低于相應癌旁組織中的表達
　　 免疫組織化學檢測60例乳腺癌樣本及相應的癌旁組織。結(jié)果顯示，65％(39/60)的原發(fā)癌組織CEACAM1表達低于癌旁組織，癌旁組織CEACAM1表達明顯高于癌組織(P<0.05)。
　　 3.驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表

25、達的相關(guān)性
　　 驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌組織中的表達與CEACAM1在乳腺癌組織中表達進行對比研究，結(jié)果顯示：P<0.05，R=-0.295，兩者有相關(guān)性，癌組織中Kif2a和CEACAM1的表達水平兩者呈負相關(guān)，Kif2a表達越高CEACAM1表達越低，反之亦然。
　　 4.癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表達與生存率有關(guān)
　　 本組60例病人從手術(shù)日起計算，5年生存率為85％(51/60)

26、，10年生存率為65％(39/60)。在CEACAM1呈中、高表達的病例中，10年生存率80％，低表達或不表達病例中，10年生存44％。CEACAM1呈中、高表達組的生存率明顯高于低表達或不表達組。CEACAM1表達與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Kif2a在乳腺癌組織中呈高表達，癌旁組織相對低表達；相反，癌組織中CEACAM1低表達，癌旁組織高表達。

27、　　 2.Kif2a和CEACAM1兩者在癌組織中的表達呈負相關(guān)，乳腺癌組織中Kif2a表達越高，CEACAM1表達越低。相反，乳腺癌組織中Kif2a表達越低，CEACAM1表達越高。
　　 3.乳腺癌組織中Kif2a和CEACAM1表達都與預后相關(guān)，Kif2a表達上調(diào)、CEACAM1表達下調(diào)或不表達的病人預后差，聯(lián)合檢測Kif2a和CEACAM1可望成為預測乳腺癌預后的重要因子。
　　 1.本課題首次檢測了乳腺癌原發(fā)

28、腫瘤和癌旁組織中Kif2a的表達情況，通過臨床病理資料分析、10年以上的隨訪，闡述了Kif2a的表達與病人轉(zhuǎn)移和預后的相關(guān)性。
　　 2.本課題首次通過應用siRNA干擾技術(shù)、體外細胞功能實驗，從細胞增殖、遷移、侵襲等方面全面、深入地探討了Kif2a，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用。
　　 3.本課題首次研究癌基因Kif2a和抑癌基因CEACAM1在同一乳腺癌組織中的表達及兩者之間的表達關(guān)系，聯(lián)合檢測乳腺癌Kif2a