擴張型心肌病的分子遺傳學機制及環(huán)境因素研究.pdf

1、研究背景:
　　擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)是臨床上一類以單側或雙側心腔擴大和心室收縮功能障礙為主要特征的常見心肌病。既往流行病學調查DCM患病率為36.5/10萬,近年來具有上升趨勢。進行性心力衰竭和各種形式室性心律失常是DCM常見嚴重合并癥,猝死風險高,因而引起研究人員廣泛關注。
　　DCM多數(shù)情況下散發(fā)存在,部分可呈現(xiàn)家族性發(fā)病趨勢,遺傳因素在DCM發(fā)病中具有主導地位。目前國內外

2、對DCM家系的大量遺傳學研究已發(fā)現(xiàn)大約30％~50%的DCM具有顯著的遺傳基礎,涉及近50個基因的相關變異。這些基因主要編碼肌小節(jié)蛋白、細胞骨架蛋白、核膜層蛋白等,如TTN、MYH7、TNNT2和LMNA等。近來有文獻報道與致心律失常性右室心肌病相關的編碼橋粒蛋白基因如DSP、DSG2、PKP2,以及一些離子通道基因如ABCC9、SCN5A,也與DCM發(fā)病有關,具有高度遺傳異質性。鑒于DCM患者易合并各種形式心律失常,甚至出現(xiàn)惡性心律失

3、常如室性心動過速(Ventricular tachycardia,VT)或心室顫動(Ventricular fibrillation,VF)而導致猝死,對DCM發(fā)生心律失常易感性的分子遺傳學機制進行深入研究具有重要意義。
　　DCM發(fā)病呈現(xiàn)男性多于女性的性別差異,然而這種差異產生的原因尚不清楚。性激素或環(huán)境激素干擾物是否是DCM發(fā)病的關鍵因素還有待研究。雙酚A(bisphenol A,BPA)是目前公認的一類環(huán)境激素干擾化合物,廣

4、泛用于制作聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等,已成為世界上產量最高的化學物質之一,無時無刻不存在于人類生產生活環(huán)境中。自從研究人員發(fā)現(xiàn)BPA可從塑料制品滲出通過飲食進入小鼠體內并致畸以來,BPA對人體健康的危害不容忽視。既往研究顯示人體持續(xù)或高水平暴露于BPA環(huán)境可引起一些激素敏感性疾病,如生殖系統(tǒng)毒性、性早熟、不明原因自然流產、乳腺癌、前列腺癌甚至導致腦損害等。近年來一些基于人群的流行病學調查數(shù)據顯示BPA與心血管疾病及其危險因素有著密切的聯(lián)系,且

5、基于動物和細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)長期BPA暴露可影響小鼠的心臟結構和功能。然而,BPA與DCM發(fā)病的相關性迄今未見報道。
　　第一部分:擴張型心肌病并室性心動過速患者的分子遺傳學機制研究
　　目的:
　　本研究通過候選基因檢測的方式,首次探索鉀通道基因與DCM并VT的分子遺傳關聯(lián)性,同時篩查DCM已知致病基因及離子通道基因新突變位點,并進一步從分子生物水平對突變基因進行功能分析,以揭示突變位點對其所編碼蛋白功能的影響,深入

6、探索DCM并VT的分子遺傳學發(fā)病機制。同時結合突變攜帶者的病歷資料,探討候選基因檢測對臨床診治的潛在指導意義。
　　方法:
　　1.臨床資料收集:經醫(yī)院倫理委員會批準,并獲得患者知情同意,收集在我院心血管內科住院且診斷為DCM并VT的患者臨床資料。DCM的診斷標準參照2006年AHA發(fā)布的心肌病當代定義和分類,以及2007年中國心肌病診斷與治療建議工作組制定的DCM診治建議。根據2006年ACC/AHA/ESC室性心律失常指

7、南中VT的診斷標準,所有入選患者均需至少采集到一次VT發(fā)作時的心電圖記錄;
　　2.候選基因篩查:采集所有入選患者的外周靜脈血2~5ml,提取DNA保存于-80℃冰箱。通過候選基因篩查方式,利用DNA直接測序法,對已知DCM致病基因和候選鉀通道基因的全部外顯子以及外顯子-內含子交界區(qū)進行篩查,包括LMNA、MYH7、TNNT2、TNNI3、PKP2、DSP、DSG2、SCN5A和KCNQ1、KCNE1、KCNE2、KCNH2,以期

8、發(fā)現(xiàn)致病基因新突變位點;對照組為400例來自相同種族但無血緣關系的健康個體以及70例不伴VT的DCM患者;
　　3.體外突變誘導及細胞轉染:在野生型質粒的基礎上,采用體外定點突變誘導技術構建突變質粒。根據突變位點設計誘導突變引物,突變誘導后通過DNA測序驗證。通過脂質體介導成功轉染突變型或野生型質粒,至人胚腎293細胞(HEK293)進行表達;
　　4.細胞膜片鉗電生理分析:應用全細胞膜片鉗技術對轉染野生型或突變型質粒的 H

9、EK293細胞的相應離子通道功能進行檢測并分析其電生理特征。在室溫記錄所有相關電生理參數(shù)如電流密度、峰值以及激活曲線等。采用Fitmaster、SigmaPlot、OriginPro7.5等軟件對數(shù)據進行分析、繪圖;
　　5.免疫熒光共聚焦檢測:采用細胞免疫熒光共聚焦檢測技術觀察突變型與野生型通道蛋白在細胞內的分布情況;
　　6.蛋白印跡(Western Blot)分析:通過提取細胞膜蛋白與漿蛋白,進行Western Blo

10、t分析轉染野生型與R397Q突變型質粒的細胞KCNQ1通道蛋白表達水平;
　　7.數(shù)據處理及統(tǒng)計學分析:所有獲取數(shù)據均采用SPSS18.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用ANOVA檢驗。結果以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.本研究共納入符合條件的DCM并VT患者10例,其中男性7例,女性3例,年齡16~77歲,平均年齡48.7±20.4歲。其

11、中2例患者合并右束支傳導阻滯,1例合并左束支傳導阻滯,超聲心動圖結果顯示左室舒張末徑53~75mm,左室收縮末徑40~67mm,左室射血分數(shù)22%~45%。
　　2.通過對候選基因編碼區(qū)的全部外顯子以及內含子-外顯子結合區(qū)進行測序并與400例正常對照以及70例不伴VT的DCM患者進行比較,共發(fā)現(xiàn)3個基因新突變位點,分別為KCNQ1-p.R397Q、DSG2-p.R824G和SCN5A-p.V1604M突變。KCNQ1-p.R397

12、Q突變:KCNQ1基因雜合子錯義突變,第1190位核苷酸由G變?yōu)锳,即c.1190G>A,從而導致第397位氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝滨０?。KCNQ1-p.R397Q突變存在于一位60歲男性DCM并VT患者。該患者入院心電圖QT正常,經射頻消融術及口服胺碘酮治療后VT復發(fā),隨后再次行射頻消融術并植入ICD,目前隨訪患者情況良好。SCN5A-p.V1604M突變:SCN5A-p.V1604M突變:SCN5A基因雜合子錯義突變,第4810位核苷

13、酸由G變?yōu)锳,即c.4810G>A,從而導致第1604位氨基酸由纈氨酸變?yōu)榈鞍彼?。該突變存在于一?1歲男性DCM并VT患者。該患者主要表現(xiàn)為胸悶氣逼癥狀。10年前曾在外院經超聲心動圖診斷DCM。入我院時心電圖提示完全性右束支傳導阻滯,心房顫動;24小時動態(tài)心電圖提示短陣VT。目前該患者已失訪,病情進展情況未知。DSG2-p.R824G突變:DSG2基因雜合子錯義突變,第2470位核苷酸由C變?yōu)镚,即c.2470C>G,從而導致第824

14、位的精氨酸被甘氨酸替代。DSG2-p.R824G突變存在于一位65歲男性DCM并VT患者,臨床表現(xiàn)為心力衰竭和暈厥,表型嚴重但拒絕行ICD或CRTD植入術,帶藥出院半年后隨訪得知在家中猝死。本研究發(fā)現(xiàn)了5個單核苷酸多態(tài)性位點( SNP),分別為KCNQ1-p.I145I、DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T、MYH7-p.I989I以及PKP2-p.P273P。其中 DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T和PK

15、P2-p.P273P為新發(fā)SNP。
　　3.全細胞膜片鉗檢測顯示R397Q突變通道與野生型相比,Iks值在電壓為-20~80mv時明顯降低,提示鉀通道功能降低;然而R397Q突變型與野生型的穩(wěn)態(tài)激活曲線以及電壓依賴失活常數(shù)均無顯著性差異。與野生型相比,R397Q突變并不影響半數(shù)激活電壓以及斜率。
　　4.免疫熒光共聚焦結果檢測提示與野生型相比,轉染R397Q突變質粒的細胞上,紅色免疫熒光幾乎全部被局限在細胞漿內,而未能到達細

16、胞膜,導致KCNQ1蛋白在細胞膜上的定位明顯下降;進一步行Western Blot分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,R397Q突變型KCNQ1蛋白在細胞膜上表達量明顯減少(P<0.01)。
　　結論:
　　1.本研究首次揭示KCNQ1基因是DCM并VT致病基因,進一步通道電生理分析顯示,KCNQ1基因R397Q突變可通過“功能減退”導致DCM并VT的發(fā)生。KCNQ1通道蛋白膜定位表達下降以及轉運缺陷均有可能參與了通道“功能減退”的病理

17、機制。
　　2.在DCM并VT患者中檢測到SCN5A基因新突變位點V1604M以及DSG2基因新突變位點R834G;提示DCM患者VT致病基因的異質性。
　　3.本研究檢測到5個SNPs,分別為KCNQ1-p.I145I、DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T、MYH7-p.I989I以及PKP2-p.P273P。其中DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T和PKP2-p.P273P為新報道SNP。據他

18、人結果報道推測KCNQ1-p.I145I多態(tài)性可能與DCM患者發(fā)生VT易感性有關。
　　4.攜帶KCNQ1-p.R397Q突變患者經射頻消融術并服用胺碘酮后仍反復發(fā)作VT,說明攜帶基因突變的患者射頻消融和藥物治療效果均欠佳,需要ICD置入治療,提示基因篩查對臨床治療的潛在指導意義。
　　5.DCM不僅是心臟結構疾病,也是與離子通道相關的電生理疾病。本研究成果將為離子通道心肌病新概念的提出提供了堅實的理論支持依據,深入研究離子

19、通道在DCM發(fā)病中的機制,將為尋找DCM治療新靶點提供科學基礎和理論依據。
　　第二部分:環(huán)境內分泌干擾化合物雙酚A與擴張型心肌病的相關性探討
　　目的:
　　檢測血清BPA水平以及性激素相關指標在擴張型心肌病病例組和健康對照組中的差異,探索血清BPA水平對DCM發(fā)病的影響,并分析BPA與性激素相關指標的關系。
　　方法:
　　1.通過采用1:1匹配病例-對照研究的方法,納入在2012年3月至2013年6月

20、期間在本院心血管內科住院并診斷為DCM的患者作為病例組。同期在本院的體檢中心根據性別年齡匹配原則選取的健康人群作為對照組。排除入組前3個月內曾接受激素治療者外,所有入選研究對象均簽署知情同意書,并對其臨床資料堅持嚴格保密原則。
　　2.所有研究對象均于入院次日或體檢當日清晨7:00至10:00采集空腹靜脈血6ml,當天分離血清并保存于-80℃低溫冰箱待集中測定血清BPA水平以及性激素相關指標包括雌二醇(E2)、睪酮(T)、性激素結

21、合蛋白(SHBG)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)。根據T值和SHBG值,利用公式計算游離雄激素指數(shù)(free androgen index)FAI值,FAI=T×100/SHBG。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定上述指標,BPA ELISA檢測試劑盒由日本IBL公司提供,其余ELISA檢測試劑盒由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供。嚴格按照試劑盒說明書要求采集并保存血清標本,根據其提供的操作步驟及要求準備試劑及控制反應

22、條件,用酶標儀測量標本光密度值(OD值)。根據標準品濃度和OD值繪制標準曲線,然后用樣品OD值計算出樣品濃度值。
　　3.研究數(shù)據采用SPSS18.0軟件包進行處理并分析。所有計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,計數(shù)資料采用百分比表示;呈正態(tài)分布數(shù)據兩組間比較采用t檢驗,非正態(tài)分布數(shù)據組間比較采用秩和檢驗;控制各項混雜因素后,采用線性回歸方法分析血清BPA水平與性激素各項指標的相關性。結果以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　

23、　結果:
　　1.共納入符合標準的DCM病例88例以及健康對照88例。其中DCM組男性59例,女性29例,男女發(fā)病比為2.0:1。DCM組平均年齡是(59.6±13.2)歲,對照組平均年齡是(59.0±12.7)歲。兩組在性別年齡比較上無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　2.血清BPA檢測結果:DCM病例組和健康對照組的血清BPA水平分別為(6.9±2.7)ng/ml,(3.8±1.9)ng/ml,兩組比較具有顯著統(tǒng)計學差異

24、(P<0.001);根據性別不同,將研究對象分為男性DCM組與男性健康對照組、女性DCM組與女性健康對照組分別進行比較,結果分別為(7.0±2.9)ng/ml vs.(3.9±2.0)ng/ml和(6.5±2.2)ng/ml vs.(3.8±1.8)ng/ml,組間比較均具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)。
　　3.性激素相關指標檢測結果:DCM病例組和健康對照組的血清 T水平、SHBG水平以及 FAI值均存在統(tǒng)計學差異,其結果

25、分別為(488.3±188.2)pg/ml vs.(555.8±165.8)pg/ml、(76.9±30.9)nmol/L vs.(41.0±15.6)nmol/L以及2.9±3.5 vs.5.3±2.6,,兩組比較均具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)。根據性別不同進行亞組分析SHBG值和FAI值均存在相似的統(tǒng)計學關聯(lián)。而且男性DCM組的血清T值高于男性健康對照組,且血清ERα值略高,結果分別為(540.8±186.0)pg/ml v

26、s.(656.3±112.9)pg/ml,P<0.001和(1.0±0.6)ng/ml vs.(0.8±0.4)ng/ml,P=0.042。除此之外,各組間的血清ERα和ERβ比較無統(tǒng)計學差異。
　　4.血清BPA與性激素水平的相關性:控制各項混雜因素后,采用線性回歸方法分析血清BPA水平與性激素各項指標的相關性,結果顯示血清BPA水平與SHBG水平呈現(xiàn)正相關性(β=0.041,95% CI(0.024-0.058),P<0.00