BMP-2和BMSCs結(jié)合N-HA-N-LDIG復合材料修復兔橈骨缺損的實驗研究.pdf

1、本文對BMP--2和BMSCs結(jié)合n--HA/n--LDIG復合材料修復兔橈骨缺損進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一章：兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導分化成骨細胞。
　　目的：探討兔BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及向成骨細胞誘導分化的方法，探討B(tài)MSCs在體外增殖，定向分化能力。
　　方法：取兔股骨的骨髓沖洗液，采用Percoll分離液密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)、純化兔BMSCs，光鏡下觀

2、察傳代細胞生長狀況和形態(tài)變化;MTT法檢測細胞增殖情況，繪制生長動力學曲線;HE染色形態(tài)觀察和流式細胞儀抗體鑒定兔BMSCs表面標記物;體外誘導P3 BMSCs向成骨細胞分化，對誘導分化為骨細胞進行Gomori鈣鈷法ALP染色和茜素紅鈣礦化結(jié)節(jié)染色鑒定向成骨分化的能力。
　　結(jié)果：所分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一，沿胞體長軸生長，呈旋渦狀、網(wǎng)狀、梭狀、放射狀，形成較典型的BMSCs。P3 BMSCs的生長曲線大致呈S型，第7～11天細胞處

3、于高速增長期，細胞數(shù)量迅速增加;HE染色BMSCs形態(tài)呈長梭形或長三角形，細胞核漿比例大，核藍染，胞漿豐富紅染。流式檢測細胞表面標記物顯示BMSCsCD44表達百分率為98.63％，呈陽性，而CD45表達呈陰性。P3BMSCs在體外經(jīng)成骨誘導3周后，Gomori鈣鈷法染色ALP呈陽性，胞漿顯示有灰黑色顆?；蜃睾谏蚝谏恋?。茜素紅染色呈陽性，細胞間出現(xiàn)致密的圓形或者卵圓形礦化結(jié)節(jié)。
　　結(jié)論：應(yīng)用Percoll分離液密度梯度離心法

4、和貼壁篩選法結(jié)合能分離、培養(yǎng)出兔BMSCs，是一種比較理想獲取兔BMSCs的方法;兔P3 BMSCs純度較高和良好的增殖能力，具有向成骨細胞定向分化的生物學特性，是組織工程理想的種子細胞，也為后續(xù)進行骨缺損修復實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　第二章：n-HA/n-LDIG復合材料的制備及與BMSCs體外復合培養(yǎng)的細胞生物學評價。
　　目的：以賴氨酸鹽，甘油及n-HA為主要原料，制備出一種新型n-HA/n-LDIG復合材料，分析其

5、與BMSCs體外復合培養(yǎng)的生物相容性，探討其作為組織工程支架的可行性。
　　方法：選擇賴氨酸鹽和甘油為原材料，通過有機合成、聚合反應(yīng)、納米化、超臨界抗溶劑結(jié)晶、超聲分散等技術(shù)制備出n-HA/n-LDIG復合材料。電鏡觀察其結(jié)構(gòu)及計算孔隙率，細胞計數(shù)法檢測細胞對復合材料的黏附能力，MTT法檢測復合材料對細胞增殖的影響，ALP活性和鈣含量測定觀察復合材料對細胞分化的影響。
　　結(jié)果：n-HA/n-LDIG復合材料肉眼為白色散在，

6、為比較均勻的粉狀固體。掃描電鏡可見類似天然松質(zhì)骨的三維孔洞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，透射電鏡可見排列不規(guī)則的晶須和空穴。共培養(yǎng)從2h至10h，隨時間細胞的黏附率有所增加，其中6h時細胞黏附率明顯高于4h時，8h時明顯高于6h時，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MTT實驗結(jié)果顯示共培養(yǎng)第2天到第16天，細胞在復合材料上數(shù)量隨時間而增加，特別是從第6天開始復合材料上的細胞數(shù)量迅速增加，細胞處于對數(shù)生長期，12天后過渡到生長平臺期，增殖緩慢。從第4天開

7、始，黏附細胞的ALP相對活性和鈣相對含量迅速上升;第8天時ALP相對活性和鈣相對含量明顯高于第4天時，第12天明顯高于第8天時，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);12天后ALP相對活性和鈣相對含量增加不明顯，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：制備的n-HA/n-LDIG復合材料具備適宜的孔隙率和孔徑，組成性質(zhì)相似于天然骨結(jié)構(gòu)，具有良好的生物學特性，是一種新型的納米骨修復材料。n-HA/n-LDIG復合材料具備良好的細胞相容性，能為

8、成骨細胞在其表面生長、增殖、分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境，是一種良好的骨修復替代材料，為其作為骨的快速修復和骨組織工程支架材料奠定了基礎(chǔ)。
　　第三章：BMP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復合材料修復兔橈骨缺損的實驗研究。
　　目的：構(gòu)建兔橈骨缺損模型，探討B(tài)MP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復合材料修復兔橈骨缺損的效果。
　　方法：取新西蘭大白兔構(gòu)建兔橈骨缺損模型，實驗組植入BMP-2和BMSCs

9、結(jié)合n-HA/n-LDIG復合材料，對照組植入BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復合材料，空白組不植入任何材料。分別于2、4、8、12周隨機處死家兔，進行動物大體觀察，X線檢查和Lane-Sandhu放射學評分觀察骨缺損處愈合情況，通過組織學檢查和Lane-Sandhu組織學評分觀察骨缺損處的修復情況。
　　結(jié)果：所有實驗動物橈骨骨缺損模型構(gòu)建均成功，未見皮下和肌肉組織充血、水腫、滲出及感染等現(xiàn)象。從大體觀察，X線檢查和組織學檢

10、查等發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，實驗組修復效果優(yōu)于對照組，對照組優(yōu)于空白組。實驗組術(shù)后3、6、9周新生骨所占骨缺損面積百分比，Lane-Sandhu放射學評分，新生骨所占骨缺損面積百分比及Lane-Sandhu組織學評分均明顯高于對照組，對照組均明顯高于空白組，其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：BMP-2明顯夠促進早期成骨，縮短成骨時間，加速骨缺損區(qū)骨組織的再生和鈣化;BMP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復合