TGF-β1在大鼠半月板發(fā)育過程中表達研究.pdf

1、半月板在膝關(guān)節(jié)具有傳導(dǎo)載荷,維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要功能,其損傷將嚴重限制膝關(guān)節(jié)運動功能。由于半月板僅紅區(qū)有血供,紅.白區(qū)、白區(qū)無血供,其營養(yǎng)主要來自關(guān)節(jié)內(nèi)的滑液。半月板損傷后,愈合的組織細胞主要來源于滑膜,關(guān)節(jié)液及纖維軟骨內(nèi)的成纖維細胞。目前臨床對半月板損傷采用手術(shù)治療,一般為切除受損部分,雖可解決癥狀,但術(shù)后半月板缺失,功能喪失,患者易早期發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)。OA臨床終術(shù)結(jié)局往往是人工關(guān)節(jié)置換,對患者造成

2、較重的經(jīng)濟和心理負擔。早期研究均認為由于半月板自身愈合能力差,幾乎無愈合能力。但近年臨床實踐研究發(fā)現(xiàn),合并前交叉韌帶(anterior crueiate ligament,ACL)損傷、行ACL重建術(shù)的損傷半月板存在愈合傾向。關(guān)于半月板愈合的基礎(chǔ)研究證實TGF-β1、HGF、EGF、BMP、PDGF等因子增加關(guān)節(jié)軟骨細胞DNA合成,促進軟骨細胞增殖。多數(shù)研究認為TGF-β1具有較強的促進半月板愈合作用。但上述研究并未考慮:TGF-β1/

3、Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用為促進炎癥反應(yīng),其中TGF-β1是中性粒細胞和單核細胞的有力趨化劑,其體內(nèi)過度表達或引入外源性TGF-β1可引發(fā)或加重炎癥反應(yīng),阻礙正常組織修復(fù),無法達到組織工程意義上的功能性修復(fù)目標。而目前尚無研究闡訴TGF-β1體內(nèi)異構(gòu)體-TGF-β3,在半月板發(fā)育、損傷修復(fù)中作用。己發(fā)表研究指出:TGF-β3未參與軟骨損傷、基質(zhì)降解等炎癥反應(yīng)過程,且促進肺和肝臟組織的纖維性修復(fù)過程。明確TGF-β3在半月板發(fā)育中作用,可

4、為半月板組織工程研究提供新的理論基礎(chǔ)和研究方向。
　　 材料和方法:
　　 選擇鼠齡1天、7天、14天、21天、28天、35天Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學動物部提供),無菌操作條件下取不同大鼠完整膝關(guān)節(jié),固定、脫鈣、石蠟包埋及切片后,采用S-P法作免疫組化,以Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件采集圖像并觀察分析。采用上述鼠齡大鼠,拖頸處死后浸泡于75％酒精中5分鐘,無菌操作下取大鼠雙側(cè)半月板(1天、7天在顯

5、微鏡下取材),Tizol法提取細胞總RNA,RNA定量為1μg/μl并行電泳純度檢測,MLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,PCR反應(yīng)體系(50μl):eDNA模板5μl+上下游引物各1μl+Premix LA Taq聚合酶25μl+dd H2018μl,反應(yīng)條件:98℃10秒,55℃30秒,72℃28秒,共35個循環(huán)。10％瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物,數(shù)碼照相并行灰度值分析(Labwork4.0分析軟件)。以目的產(chǎn)物狄度值表示結(jié)果。
　

6、　 結(jié)果:
　　 1、免疫組化發(fā)現(xiàn)大鼠由出生到成鼠過程中,TGF-β3表達從關(guān)節(jié)囊丌始逐漸擴展至紅區(qū)、紅白區(qū)、白區(qū);
　　 2、RT-PCR結(jié)果顯示上述過程中TGF-β3表達增加(1天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值77.618、7天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值80.855、14天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值84.238、21天wistar大鼠半