構(gòu)建鐵皮石斛多維指紋圖譜方法的研究.pdf

1、鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，是一種名貴的藥用植物。由于鐵皮石斛特殊的生長環(huán)境和人們的過度采挖，目前鐵皮石斛的野生資源已日趨枯竭，市場資源十分混亂。為促進該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，本文構(gòu)建了鐵皮石斛毛細管電泳指紋圖譜、SRAP分子指紋圖譜和多糖指紋圖譜。 (1)毛細管電泳指紋圖譜的構(gòu)建：通過對提取條件和檢測條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以40mM硼砂(pH9.5，含5％甲醇)為運行緩沖液，以20％乙醇為提取溶劑，能從10種產(chǎn)地鐵皮石斛中得到15個特征指紋

2、峰，并以第9號峰為內(nèi)參比峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積可作為指紋信息。在此基礎上，對不同產(chǎn)地鐵皮石斛藥材進行了相似度分析、主成分分析、系統(tǒng)聚類分析，10種產(chǎn)地鐵皮石斛可以被分為三類：浙江溫州、浙江雁蕩山、浙江富陽、江西、云南、廣西、廣東產(chǎn)地鐵皮石斛聚為第一類，福建、安徽產(chǎn)地鐵皮石斛聚為第二類，湖南產(chǎn)地鐵皮石斛聚為第三類。此外，采用逐步判別法選取四個特征指紋峰面積(X<,2>、X<,7>、X<,11>、X<,13>)為原始數(shù)據(jù)，構(gòu)

3、建其典型判別函數(shù)，將待分類樣品6個特征指紋峰的相對峰面積代入上述方程即可算出其所屬類別。 (2)DNA分子指紋圖譜的構(gòu)建：通過對SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化，確立了鐵皮石斛SRAP-PCR最佳反應體系：模板DNA30ng，dNTP0.25 mM，引物濃度0.1μM，Mg<'2+>濃度2.0 mM，Taq DNA聚合酶1.5 U，10×PCR Buffer 2.5μL，總反應體積為25μL。用四對引物組合對七種產(chǎn)地鐵皮石斛進行擴

4、增，共得到77條帶，其中特異性分子標記39個，多態(tài)率達51％。四對引物中，Me5-Em6組合具有較多的多態(tài)性位點，Rp值也較高。遺傳距離和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明：七種產(chǎn)地鐵皮石斛被分為四類，浙江溫州、廣東、廣西為第一類；湖南為第二類；浙江雁蕩山，江西為第三類；云南為第四類。 (3)多糖指紋圖譜的構(gòu)建：采用熒光輔助糖電泳技術(shù)構(gòu)建了鐵皮石斛多糖的酶解指紋圖譜。多糖經(jīng)β-甘露聚糖酶和纖維素酶分別水解，產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，發(fā)現(xiàn)不