板藍(lán)根化學(xué)成分與多維指紋圖譜研究.pdf

1、板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)的干燥根,具有清熱解毒、涼血利咽之功效,臨床上常用于病毒性疾病和細(xì)菌性感染疾病。本論文以板藍(lán)根藥材為研究對象,分別從LC/DAD/ESI/MS/MS成分分析、單體的制備和結(jié)構(gòu)確認(rèn)、含量測定、提取工藝優(yōu)化、指紋圖譜與多維指紋圖譜和抗內(nèi)毒素藥理研究五方面進(jìn)行實驗,為提高板藍(lán)根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、合理利用藥材資源提供依據(jù)。
　　 一、板藍(lán)根的化學(xué)成分研究
　　

2、 采用LC/DAD/ESI/MS/MS聯(lián)用法,對板藍(lán)根的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。通過一級和二級質(zhì)譜圖解析,供試品與對照品色譜峰的保留時間和紫外光譜對比,鑒定了其中5種化合物,分別是:胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和告伊春。根據(jù)質(zhì)譜解析和文獻(xiàn)結(jié)果,認(rèn)定了7種化合物,分別是:精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、依靛藍(lán)酮、水楊酸、板藍(lán)根木脂苷A和羥基靛玉紅。比較板藍(lán)根水提物和乙醇提取物之間的差別,證明水提物能更全面的反映板藍(lán)根的內(nèi)在化學(xué)成分,確定水提醇沉法為板藍(lán)

3、根研究的提取方法。
　　 《中國藥典》1995年版將十字花科植物馬藍(lán)(Baphicacanthus cusia(Nees)Brem.)作為南板藍(lán)根入藥,本實驗利用LC/MS手段對馬藍(lán)根進(jìn)行分析,紫外和質(zhì)譜色譜圖均顯示,馬藍(lán)根與菘藍(lán)根的成分存在很大差異。
　　 二、板藍(lán)根中告伊春的制備與確認(rèn)
　　 采用大孔吸附樹脂對板藍(lán)根水提醇沉物進(jìn)行粗分離,經(jīng)乙酸乙酯萃取,利用半制備液相色譜儀進(jìn)行分離純化獲得單體,制得的單體經(jīng)E

4、I-MS、1H-NMR和13C-NMR分析,確認(rèn)為告伊春,旋光分析顯示其為消旋體。本方法操作簡便、快速、產(chǎn)率高、純度高、成本低,適于推廣。
　　 三、板藍(lán)根中核苷類成分和告伊春的含量測定
　　 建立了以甲醇和NaH2PO4-H3PO4緩沖液為流動相,等度沈脫同時測定板藍(lán)根中尿苷、腺苷和鳥苷含量的RP-HPLC法。測得尿苷在0.0107～0.107 mg·mL-1范圍內(nèi)r=0.9996,平均回收率101.0％(RSD=1.

5、3％)；腺苷濃度在0.0101～0.101 mg·mL-1范圍內(nèi)r=0.9996,平均回收率98.6％(RSD=1.1％)；烏苷濃度在0.0106～0.106 mg·mL-1范圍內(nèi)r=0.9995,平均回收率98.8％(RSD=1.2％),為完善板藍(lán)根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的依據(jù)。
　　 采用該方法,測定了19批樣品,發(fā)現(xiàn)核苷類物質(zhì)的含量差異較大,甚至可達(dá)二倍以上。藥材的種源、生長地域及生長環(huán)境的不同導(dǎo)致這種差異。
　　 建

6、立了板監(jiān)根中告伊春的RP-HPLC含量測定方法,以甲醇-水(15:85,v/v)為流動相,測得告伊春的含量在0.0107～0.1284mg·mL-1范圍內(nèi)r=0.9999,平均回收率102.2％(RSD=0.5％),該方法簡便、快速、準(zhǔn)確。16批樣品的含量測定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)藥材中告伊春的含量與核苷的含量無正相關(guān)性。
　　 四、板藍(lán)根注射液生產(chǎn)工藝優(yōu)化
　　 利用均勻設(shè)計法和單因素考察法對板藍(lán)根注射液生產(chǎn)中幾項工藝指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化

7、,并對藥材的粉碎程度、浸泡時間進(jìn)行考察,結(jié)合實際生產(chǎn),制定板藍(lán)根注射液生產(chǎn)工藝。
　　 五、板藍(lán)根指紋圖譜及多維指紋圖譜研究
　　 建立了板監(jiān)根的梯度沈脫HPLC指紋圖譜,為結(jié)合實際生產(chǎn)同時建立等度沈脫HPLC指紋圖譜,為藥材的質(zhì)量控制方法奠定了基礎(chǔ)。在板藍(lán)根HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上,對20批樣品的色譜圖進(jìn)行聚類分析,梯度洗脫和等度沈脫聚類結(jié)果具有一致性。采用國家藥典委員會的計算機輔助相似度評價系統(tǒng)(相似度評價系統(tǒng))和混

8、批樣品建立兩種共有模式,采用三種測度計算相似度,相同樣品的梯度沈脫和等度沈脫相似度趨于一致。為全面反應(yīng)藥材化學(xué)成分,實現(xiàn)準(zhǔn)確判別,推薦使用梯度洗脫進(jìn)行指紋圖譜分析。利用相似度評價系統(tǒng)計算相似度時,應(yīng)與含量測定相結(jié)合,用雙指標(biāo)體系判定,以避免對含量低但相對含量關(guān)系類似的譜圖的誤判。分析結(jié)果表明,板監(jiān)根藥材指紋圖譜的相似度大于0.9者為合格品。比較了板藍(lán)根藥材、中間體和注射液圖譜間的相關(guān)性,還考查了相同填料不同品牌色譜柱對指紋圖譜研究的影響

9、。
　　 本實驗還建立了板藍(lán)根的LC/MS指紋圖譜,在質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)中反映了紫外沒有吸收的組分和混合組分對指紋圖譜相似度的貢獻(xiàn),與液相色譜指紋圖譜互為補充,更加全面地反映板藍(lán)根藥材的質(zhì)量。選擇6批板藍(lán)根樣品,以腺苷的萃取離子色譜峰為內(nèi)參比峰,計算各色譜峰的相對峰面積,進(jìn)一步計算樣品的相似度。比較了各樣品TIC相似度和紫外檢測色譜圖相似度,兩種方法對樣品的評價趨勢基本一致。
　　 六、板藍(lán)根抗病毒和抗內(nèi)毒素活

10、性研究
　　 1.抗病毒實驗對三個主要成分做了體外抗病毒藥理實驗,經(jīng)實驗證明,尿苷、鳥菅、腺苷有抗A1型流感病毒(H1)和抗腺病毒Ⅲ型(adv-3)的作用,為尋找板藍(lán)根水溶性抗病毒成分做了初步的探索。
　　 2.抗內(nèi)毒素實驗四項藥理實驗顯示,板藍(lán)根具有較強的抗內(nèi)毒素作用,對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的發(fā)熱和急性肝損傷有預(yù)防和保護作用。
　　 (1)家兔發(fā)熱實驗板藍(lán)根總提物和告伊春粗提物經(jīng)腹腔注射給藥后,對內(nèi)毒素致發(fā)熱既有顱防作用

11、又有保護作用,能顯著降低家兔體溫,對機體起到保護作用。實驗結(jié)果表明,板藍(lán)根總提物降溫效果優(yōu)于告伊春粗提物。
　　 (2)小鼠急性肝損傷實驗板藍(lán)根總提物和告伊春粗提物對內(nèi)毒素致小鼠休克/死亡有不同程度的保護作用,其保護作用與陽性對照組相近,甚至優(yōu)于陽性對照組。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷實驗谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定結(jié)果與死亡率實驗具有一致性,能進(jìn)一步說明板監(jiān)根對肝臟的保護作用。
　　 3.告伊春的藥動學(xué)研究以告伊春為指標(biāo),研究了板藍(lán)根

12、總提物和告伊春粗提物在家兔體內(nèi)的藥物動力學(xué)。血漿樣品經(jīng)二氯甲烷-異丙醇(4:1,v/v)萃取處理后,以乙腈-水(80:20,v/v)為流動相,流最1.0 mL·min-1,對乙酰氨皋酚為內(nèi)標(biāo),經(jīng)DiamonsilTMC18(4.6×250 mm,I.D.5μm)柱分離。線性范圍為0.123～4.90μg·mL-1,定量下限為0.123μg·mL-1。7只家兔腹腔注射板藍(lán)根總提物后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tmax為0.4±0.2 h,Cmax為1

13、.61±0.44μg·mL-1,t1/2為1.67±0.52 h,AUC0-t為4.24±1.09μg.mL-1;家兔腹腔注射告伊春粗提物后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tmax為0.4±0.2 h,Cmax為2.66±0.44μg·mL-1,t1/2為1.88±0.48 h,AUC0-t為7.51±1.40μg·mL-1。除因給藥劑量不同造成的Cmax值不同外,Tmax、t1/2、MRT值t檢驗分析均無顯著性差異。藥物動力學(xué)分析為板藍(lán)根更深入研究提