柘木化學(xué)成分及指紋圖譜研究.pdf

1、目的
　　 1．通過(guò)正交試驗(yàn)，優(yōu)選柘木總黃酮的提取工藝，為柘木總黃酮的開(kāi)發(fā)和利用提供參考；對(duì)柘木醇浸膏的乙酸乙酯和正丁醇部分進(jìn)行化學(xué)成分分離與鑒定，并對(duì)所得單體化合物進(jìn)行藥理活性篩選，尋找柘木抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物提供理論依據(jù)，同時(shí)為建立柘木藥材的指紋圖譜提供指標(biāo)參數(shù)。
　　 2．通過(guò)柘木5種黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定及應(yīng)用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法對(duì)10種不同商品藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為柘木商品藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)柘

2、木中36種無(wú)機(jī)微量元素的含量測(cè)定和分析，為進(jìn)一步探討柘木的抗癌作用機(jī)理提供一定的理論參考。
　　 3．通過(guò)建立柘木藥材HPLC指紋圖譜分析方法，為其質(zhì)量控制和藥材鑒別提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1．材料：柘木：?？浦参镨蠘?shù)Cudrania tricuspidata（Carr．）Bur．的干燥根及藤莖。實(shí)驗(yàn)材料采自廣西省南寧市郊外，由廣西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵老師提供并鑒定，各商品藥材購(gòu)自廣西各地

3、和安國(guó)藥材市場(chǎng)。
　　 2．方法：（1）采用正交試驗(yàn)的方法，以總黃酮和出膏率為指標(biāo)，優(yōu)選柘木的最佳提取工藝；通過(guò)硅膠柱層析，凝膠柱層析，重結(jié)晶等手段，從柘木的乙酸乙酯層和正丁醇層分離、純化單體化合物。（2）利用MTT還原法，對(duì)分離得到的2種單體化合物進(jìn)行抗人宮頸癌HeLa細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外活性篩選。（3）采用HPLC色譜法測(cè)定柘木藥材中5種黃酮類(lèi)成分的含量，并應(yīng)用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法對(duì)10批不同商品藥材進(jìn)行分析和質(zhì)量

4、評(píng)價(jià)；同時(shí)采用微波消解法對(duì)柘木不同商品和不同部位進(jìn)行消解處理后，用等離子體電感耦合等離子體質(zhì)譜議（ICP-MS）檢測(cè)其中36種無(wú)機(jī)元素。（4）采用HPLC法，色譜柱：Aglinet C18（150×4.6mm，5μm）；洗脫條件：乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1，以二氫桑色素為參照物建立柘木藥材的指紋圖譜。
　　 結(jié)果：
　　 1．化學(xué)成分研究：（1）以

5、總黃酮和出膏率為指標(biāo)得到柘木最佳提取工藝為：12倍量60％乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)。（2）從柘木的乙酸乙酯和正丁醇部分分離并鑒定了10個(gè)單體化合物，分別為：Ⅰ（β-谷甾醇）、Ⅱ（胡蘿卜苷）、Ⅲ（槲皮素）、Ⅳ（山柰酚）、Ⅴ（5，7，4’-三羥基二氫異黃酮）、Ⅵ（大戟烷-7，24-二烯-3-醇）、Ⅶ（花旗松素）、Ⅷ（大戟烷-7，24-二烯-3-乙酸酯）、Ⅸ（二氫桑色素）、Ⅹ（環(huán)桂木黃素）。其中化合物Ⅲ（槲皮素）、Ⅳ（山柰酚）、Ⅴ（5，7

6、，4’-三羥基二氫異黃酮）、Ⅶ（花旗松素）、Ⅸ（二氫桑色素）、Ⅹ（環(huán)桂木黃素）均為黃酮類(lèi)化合物，可為柘木抗癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考，同時(shí)為藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和指紋圖譜的建立提供更多的指標(biāo)參數(shù)。
　　 2．體外抗癌活性篩選結(jié)果顯示：二氫桑色素和環(huán)桂木黃素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制效果與5-氟尿嘧啶相比：環(huán)桂木黃素>5-氟尿嘧啶>二氫桑色素；對(duì)胃癌SGC-7

7、901細(xì)胞的抑制效果與5-氟尿嘧啶相比：5-氟尿嘧啶>環(huán)桂木黃素>二氫桑色素。
　　 3．含量測(cè)定研究：（1）柘木中5種黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定結(jié)果顯示：10批商品藥材之間的5種成分含量差異較大，因此不能根據(jù)某一成分含量的高低來(lái)評(píng)價(jià)其商品質(zhì)量的好壞，所以本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法以5種黃酮類(lèi)成分作為綜合指標(biāo)對(duì)這10批藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將商品藥材的質(zhì)量分為四個(gè)等級(jí)：優(yōu)質(zhì)品，較好，一般和較差。（2）本文采用ICP-M

8、S法對(duì)不同商品柘木藥材和不同藥用部位中的36種無(wú)機(jī)微量元素進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示：柘木藥材中富含對(duì)人體有益的無(wú)機(jī)微量元素，其有害金屬元素的含量均較低。
　　 4．采用HPLC法，以二氫桑色素作參照物，建立了柘木藥材的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出共有峰12個(gè)，其中有4個(gè)峰已確定了歸屬，各樣品相似度均在0.9以上。
　　 結(jié)論：
　　 1．化學(xué)成分研究：（1）本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法，首次確定了以柘木總黃酮為指標(biāo)的最佳提

9、取工藝。（2）本實(shí)驗(yàn)從柘木中分離鑒定出10個(gè)單體化合物，其中化合物環(huán)桂木黃素為首次從柘木中分離得到；大戟烷-7，24-二烯-3-醇和大戟烷-7，24-二烯-3-乙酸酯為首次從?？浦参镏蟹值谩?br>　　 2．體外抗癌活性篩選：（1）二氫桑色素和環(huán)桂木黃素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和胃癌SGC-7901均有不同程度的抑制作用。（2）通過(guò)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化推測(cè)出這兩種化合物的抗癌機(jī)理可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞

10、凋亡而發(fā)揮作用的。
　　 3．含量測(cè)定研究：（1）本文對(duì)不同商品柘木藥材的5種黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，并根據(jù)多指標(biāo)成分應(yīng)用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法對(duì)10種不同商品藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，可為柘木藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。（2）采用ICP-MS法首次測(cè)定了柘木中36種微量元素的含量，并進(jìn)行比較分析，測(cè)定結(jié)果可以為進(jìn)一步探討柘木的抗癌機(jī)理提供一定的參考，并能為其使用的安全性、無(wú)毒害性提供可靠的依據(jù)。
　　 4．指紋圖譜研究：首次采用