mTOR、MPF在細胞及口腔腫瘤生長與增殖中的調(diào)控作用.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文mT、MPF在細胞及口腔腫瘤生長與增殖中的調(diào)控作用姓名：劉奕申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：細胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：于秉治20040401吸取上清，考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白濃度。用6％，10％，15％SDSPAGE電泳分離，BIORAD電泳板，雙板條件為：150V，30mA。然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)2h50V的轉(zhuǎn)印后TrBS洗膜3次，每次5min。用含5％BSA的TrBS封閉，4℃過夜，再分別與抗mTOR抗體(1：60

2、0)、抗p70S6K抗體(1：600)、抗4EBPI抗體(1：600)室溫孵育2h，與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗鼠的二抗(1：5000)室溫孵育lh，ECL系統(tǒng)顯影。4pToS6K的活性測定收集細胞，用PBS清洗細胞后在500m裂解緩沖液中裂解。裂解緩沖液成份為含有10mMpotassiumphosphate／1mMEDTA／5mMEGTA／10mMMgCl2／50mM[3glycerophosphate／1mMNa3V04／2mMDTr／

3、40∥mlPMSF／01％NP40。提取物用C18抗體4℃孵育30min。免疫復(fù)合物與蛋白G偶聯(lián)珠反應(yīng)30rain后用裂解緩沖液洗兩次，激酶緩沖液洗一次。清洗過后免疫復(fù)合物與含有100“M未標(biāo)記ATP，200t工Ct／ml[y鹽P]ATP，125tMpTOS6K肽底物(序列：RBRKSSLRA)30℃反應(yīng)30min，加入20一250mMEDTA，煮沸5min，終止反應(yīng)。離心后取25一點子WbatmanP81強陽離子交換濾紙(1cm2cm

4、)上，用Beckman液閃計數(shù)儀測定cpm值。5mIDR的活性測定方法同4，底物為pTOS6K。6免疫組織化學(xué)法對口腔鱗狀細胞癌、腮腺腺泡細胞癌、腮腺腺癌組織石蠟標(biāo)本進行mTOR、pTOS6K、4EBPl免疫組織化學(xué)染色，觀察其表達并分析其意義。結(jié)果1roTOR及其底物在Heh細胞不同時相的表達RTPCR的結(jié)果表明：在Gl、S、G2、M1、M2幾個細胞周期時相中，mTOR的mRNA的表達無明顯變化。roTOR的底物p70S6K的亞型儀l