激光針灸及灸法的生物物理機理探索.pdf

1、針灸包括針灸理論、腧穴、針灸技術(shù)以及相關(guān)器具，在形成、應(yīng)用和發(fā)展的過程中，具有鮮明的中華民族文化與地域特征，是基于中華民族文化和科學(xué)傳統(tǒng)產(chǎn)生的寶貴遺產(chǎn)。在20世紀70年代，有研究者開始提出肥大細胞與經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象有關(guān)系的假說，該假說認為針刺使較敏感的肥大細胞受刺激或損傷，從而釋放出活性物質(zhì)，這些物質(zhì)進一步激發(fā)了局部的經(jīng)絡(luò)感傳現(xiàn)象[1]。隨后越來越多的報道發(fā)現(xiàn)穴位處的肥大細胞數(shù)量的確較旁開組織要多，而且肥大細胞作為一種免疫細胞，在收到刺激后會釋

2、放組胺，對人體起著重要的調(diào)節(jié)作用。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步，針灸也在不斷地發(fā)展，例如激光針灸就是一個很好的例子。然而其許多治療機理仍然是個迷，大大的限制了針灸方法的傳播和應(yīng)用。我們實驗室已有的研究結(jié)果表明，肥大細胞在激光刺激下會產(chǎn)生脫顆粒釋放組胺現(xiàn)象，然而肥大細胞內(nèi)部的信號傳遞過程仍然不得而知；灸法的機理研究還很少，而關(guān)于灸法熱作用的研究就更是缺乏?；谶@些情況，本文利用掃描共聚焦顯微鏡和熒光光譜方法，研究了激光照射以及不同的熱刺激作用對

3、RBL-2H3肥大細胞胞內(nèi)鈣離子濃度及其脫顆粒釋放組胺的影響，并對作用機制進行了探討，具體結(jié)果如下：
　　 首先，為了觀察激光波長對肥大細胞脫顆粒釋放組胺的影響，采用波長、功率、照射時間分別為406nm-0.081mW--25min＼530nm--0.086mW--25min＼632nm-0.423mW--5min三組，在吸收能量在同一數(shù)量級的情況下，406nm釋放組胺量最高，632nm其次，530nm最低，與細胞色素C氧化酶的

4、吸收光譜吻合，說明細胞色素C氧化酶就是激光針灸過程中的靶點。細胞色素C氧化酶接受光子后會產(chǎn)生活性氧，改變線粒體的外膜通透性；對細胞內(nèi)的細胞色素C進行熒光標記，發(fā)現(xiàn)在激光照射后細胞色素C濃度增加；對細胞質(zhì)pH值進行監(jiān)測，對30個細胞pH值熒光進行統(tǒng)計分析得到結(jié)果表明激光刺激后，肥大細胞細胞質(zhì)確實出現(xiàn)堿性化；根據(jù)已有文獻報道，細胞質(zhì)堿性化將導(dǎo)致細胞膜上的TRPV通道開啟，并且使外鈣內(nèi)流，鈣離子作為細胞內(nèi)最重要的第二信使之一，鈣離子濃度升高將

5、導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒。Bcl-2可以有效地抑制線粒體膜通透性的改變，當對上述的實驗采用Bcl-2預(yù)先處理，發(fā)現(xiàn)激光照射后，肥大細胞質(zhì)中細胞色素C濃度和pH值沒有變化，細胞的組胺釋放量也沒有增加，說明了在肥大細胞受激光刺激釋放組胺的實驗過程中，信號起始于線粒體內(nèi)，當對這一信號源進行阻斷，后面的所有現(xiàn)象都不會發(fā)生。因此我們就通過實驗發(fā)現(xiàn)了激光刺激肥大細胞釋放組胺整個細胞內(nèi)的信號傳遞過程。
　　 其次，在RBL-2H3肥大細胞熱刺激研究

6、中，采用自制加熱樣品池來滿足對細胞加熱同時觀察的條件；用程序控溫儀測量細胞環(huán)境溶液的溫度，以保證溫度測量的正確性。對細胞線性加熱刺激，通過多次的實驗統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)采取含鈣離子的HEPES緩沖液作為細胞加熱環(huán)境溶液時，細胞受熱刺激，內(nèi)部鈣離子在27℃后開始逐漸增加，在每一個TRPV開啟溫度點，都發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部的鈣離子濃度迅速的增加；在60℃時，細胞內(nèi)鈣離子濃度為初始濃度2～3倍；當采用含有釕紅(RR，阻斷TRPV通道試劑)的HEPES緩沖液

7、時，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部鈣離子濃度隨溫度升高緩慢上升，但是在各個TRPV開啟溫度點沒有明顯變化，最高濃度約為初始濃度的1.5倍；而在完全無外界鈣離子的生理鹽水條件下，仍然發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部鈣離子濃度隨溫度升高緩慢上升，但是在各個TRPV開啟溫度點沒有明顯變化，最高濃度約為初始濃度的1.5倍，與加RR阻斷劑結(jié)果相似，證明細胞內(nèi)的鈣庫在溫度刺激導(dǎo)致鈣離子濃度升高現(xiàn)象中起著重要的作用，也證明TRPV是細胞膜上主要響應(yīng)溫度刺激的離子通道。隨后對組胺濃度測試發(fā)

8、現(xiàn)組胺的釋放與溫度呈量效關(guān)系。對細胞直接加入65℃的HEPES緩沖液刺激，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部的鈣離子濃度也迅速增加，增幅到達3倍，說明加熱速率并不是導(dǎo)致細胞內(nèi)部鈣離子濃度升高的主要因素；細胞在65℃左右開始破裂，細胞內(nèi)鈣離子濃度下降，暗示灸法中最高溫度閾值不需要超過65℃。
　　 因此，激光刺激作用于肥大細胞，通過線粒體啟動細胞內(nèi)的信號傳遞過程，線粒體膜通透性增強，細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，細胞質(zhì)堿性化，導(dǎo)致細胞膜TRPV通道開啟，胞