中藥超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分及藥效學(xué)劑量對(duì)比研究.pdf

1、1、目的與意義
　　 中藥飲片的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史,為保障人民健康做出了重大貢獻(xiàn)。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,人民群眾生活水平的提高,中藥飲片煎煮麻煩、服用不便、質(zhì)量不穩(wěn)定、衛(wèi)生狀況差等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了中醫(yī)臨床的發(fā)展。20世紀(jì)90年代,超微粉碎技術(shù)成功應(yīng)用于中藥材加工,它以細(xì)胞破壁為目的,現(xiàn)已對(duì)400多種常用中藥材制備成中藥超微飲片。中藥材經(jīng)超微粉碎后,有利于藥物有效成分的溶出,提高了藥效,從而可以減少藥材用量。由于細(xì)胞破壁后有效成分

2、的快速大量釋出,超微飲片欲應(yīng)用于臨床,必須要重新確定其使用劑量。目前,超微飲片臨床用量與療效關(guān)系研究不夠明確。而中藥復(fù)方是臨床治療疾病的主要形式,故對(duì)中藥復(fù)方超微飲片的量效關(guān)系研究更有意義?；谝陨夏康?本項(xiàng)目選取小柴胡湯、葛根芩連湯2個(gè)經(jīng)典復(fù)方為代表,對(duì)其超微飲片與傳統(tǒng)飲片從化學(xué)成分及藥效學(xué)兩方面進(jìn)行對(duì)比研究,為中藥超微飲片替代傳統(tǒng)飲片應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1 超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成

3、分對(duì)比研究
　　 取超微飲片各樣品少許,制成臨時(shí)水裝片,顯微鏡下測(cè)量粒徑大小并觀察細(xì)胞破壁情況。采用薄層色譜法對(duì)小柴胡湯黃芩苷成分及葛根芩連湯葛根素、鹽酸小檗堿及黃芩苷3種化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別；測(cè)定并比較超微飲片與傳統(tǒng)飲片水溶性浸出物重量。
　　 采用紫外分光光度法測(cè)定不同溶劑量(5倍,10倍,20倍)小柴胡湯總黃酮及葛根芩連湯黃連總生物堿溶出量(mg·g-1)并作比較；比較相同溶劑量(20倍)、不同浸泡(或煎煮)時(shí)間總

4、黃酮及黃連總生物堿溶出量。采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定小柴胡湯中黃芩苷、葛根芩連湯中葛根素溶出量并作比較；測(cè)定相同溶劑量、不同浸泡(或煎煮)時(shí)間黃芩苷及葛根素溶出量并作比較。
　　 2.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量對(duì)比研究
　　 采用小鼠免疫性肝損傷模型觀察小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對(duì)小鼠肝臟、脾臟、胸腺臟器指數(shù),血清ALT與AST活性及肝臟病理改變的影響；采用MTT比色法觀察兩種飲片對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞

5、增殖的影響,比較超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性。采用小鼠小腸炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)與體外抑菌實(shí)驗(yàn)比較葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性。
　　 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 3.1 超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分定性定量分析結(jié)果
　　 3.1.1超微飲片粒度檢測(cè)
　　 顯微鏡下可見(jiàn)超微飲片破壁細(xì)胞占視野的95％以上,顆粒直徑一般2～30μm。除個(gè)別石細(xì)胞、木纖維等可見(jiàn)完整細(xì)胞外,其余均無(wú)完整細(xì)胞。
　　 3

6、.1.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片薄層色譜鑒別
　　 在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品相同位置上,超微飲片、傳統(tǒng)飲片均出現(xiàn)相同斑點(diǎn),且超微飲片較傳統(tǒng)飲片斑點(diǎn)更明顯；陰性對(duì)照品相同位置未見(jiàn)斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,中藥材經(jīng)超微粉碎后化學(xué)成分沒(méi)有改變,保持了原藥材藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3.1.3 超微飲片與傳統(tǒng)飲片水溶性浸出物量比較
　　 在相同條件下,小柴胡湯超微飲片的水溶性成分溶出量顯著多于傳統(tǒng)飲片(P<0.01),約為傳統(tǒng)飲片的2倍；葛根

7、芩連湯超微飲片水溶性浸出物是傳統(tǒng)飲片的1.5倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,中藥材經(jīng)超微粉碎后,可以增加水溶性成分的溶出量,從而顯著地提高了浸膏得率。
　　 3.1.4小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出量測(cè)定
　　 在相同溶劑量條件下,超微飲片總黃酮、黃芩苷溶出量顯著大于傳統(tǒng)飲片(P<0.01),約是傳統(tǒng)飲片的1.5～2倍；且有效成分溶出量隨溶劑量的增多而增多。20倍溶劑量條件下,有效成分溶出最多。
　　 3.1.5

8、小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出速度比較
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在相同溶劑量條件下,浸泡(或煎煮)不同時(shí)間,超微飲片中總黃酮、黃芩苷的溶出量顯著多于傳統(tǒng)飲片,兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；超微飲片組內(nèi)比較,浸泡不同時(shí)間總黃酮、黃芩苷溶出量無(wú)顯著性差異(P>0.7),提示超微飲片有效成分在短時(shí)間內(nèi)可快速溶出。傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出量與煎煮時(shí)間呈正相關(guān),在60min時(shí)溶出最多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,藥材經(jīng)超微粉碎后細(xì)胞

9、破壁,細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出速率顯著加快。
　　 3.1.6葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片中黃連總生物堿、葛根素溶出量比較
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在相同條件下,葛根芩連湯超微飲片中黃連總生物堿的溶出量是傳統(tǒng)飲片的1.74倍；葛根素溶出量是傳統(tǒng)飲片的1.37倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,中藥材經(jīng)超微粉碎后,有效成分溶出量增加。
　　 3.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性
　　 3.2.1小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量

10、相關(guān)性研究
　　 在小鼠免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?模型組ALT、AST活性顯著升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯組,超微飲片與傳統(tǒng)飲片1、2組均可顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清ALT活性(P<0.05)；超微飲片1、2組與傳統(tǒng)飲片1組均可降低血清AST活性,與模型對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)苯雙酯組對(duì)降低血清AST活性不顯著。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知,在降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性方面,超微

11、飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/4倍。聯(lián)苯雙酯組、超微飲片1組與傳統(tǒng)飲片1組均可減輕肝臟病理?yè)p傷程度,與模型對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05),提示小柴胡湯對(duì)肝臟損傷具有保護(hù)作用。在改善肝臟病理方面,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組脾臟指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),表明免疫性肝損傷小鼠脾臟增大、腫脹明顯；肝臟及胸腺指數(shù)沒(méi)有顯著改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各給藥組對(duì)肝、脾、胸腺臟器指數(shù)影響不顯著。

12、r>　　 在脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,超微飲片與傳統(tǒng)飲片1、2組均可抑制脾淋巴細(xì)胞增殖,與模型對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖影響不顯著。對(duì)超微飲片與傳統(tǒng)飲片劑量進(jìn)行分析可知,在抑制淋巴細(xì)胞增殖方面,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。
　　 3.2.2葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量對(duì)比研究
　　 在小腸炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比較,黃連素組、超微飲片1～4組及傳統(tǒng)飲片1

13、組均能降低正常小鼠小腸炭末推進(jìn)率,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明有顯著性差異(P<0.05),提示藥物通過(guò)抑制小腸的蠕動(dòng)起到止瀉作用；小腸炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/16倍。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中,阿莫西林組、超微飲片1組與傳統(tǒng)飲片1組均能抑制金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌及志賀痢疾桿菌的生長(zhǎng),與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知,在相同劑量下,超微飲片抑菌作用優(yōu)于傳統(tǒng)飲片；體外抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,超微飲

14、片最低有效抑菌劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。
　　 4、研究結(jié)論
　　 4.1因中藥材質(zhì)地各異,經(jīng)超微粉碎后,細(xì)胞破壁率一般可達(dá)90％以上。顯微鏡下可見(jiàn)絕大部分為顆粒狀物質(zhì),平均粒徑在2～30μm,個(gè)別大的團(tuán)塊直徑達(dá)100μm。除極個(gè)別石細(xì)胞、木纖維等可見(jiàn)完整細(xì)胞外,其余均無(wú)完整細(xì)胞形態(tài)。4.2中藥超微飲片保持了中藥材固有的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥材經(jīng)超微粉碎細(xì)胞破壁后,粒徑雖然達(dá)到微米級(jí),但其細(xì)化程度尚不涉及原子或分子結(jié)構(gòu)層面

15、的變化,因此保持了中藥材固有的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。薄層色譜鑒別實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),超微飲片與傳統(tǒng)飲片均顯示出相同位置、相同性質(zhì)的斑點(diǎn),提示兩種飲片中化學(xué)成分一致,超微粉碎不會(huì)改變藥材的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 4.3中藥超微飲片有效成分溶出量顯著增加,溶出速率顯著加快。中草藥的主要有效成分通常分布于細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間質(zhì),且以細(xì)胞內(nèi)為主。與傳統(tǒng)飲片相比,中藥超微飲片細(xì)胞破壁后,細(xì)胞內(nèi)有效成分不經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜阻擋而直接溶出,有效化學(xué)成分溶出量約為傳統(tǒng)飲

16、片的2倍。中藥超微飲片不需煎煮,開(kāi)水浸泡10min有效成分即可大量溶出。
　　 4.4藥效學(xué)研究結(jié)果提示,中藥超微飲片應(yīng)用于臨床,可以顯著減少藥材使用量,但不同方劑、不同觀察指標(biāo)的選擇可能影響兩種飲片的量效關(guān)系。在小柴胡湯對(duì)小鼠免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)中,超微飲片是傳統(tǒng)飲片的1/4劑量即可顯著降低ALT活性水平,而超微飲片是傳統(tǒng)飲片的1/2劑量時(shí)才能改善AST活性水平及肝臟病理?yè)p傷；在葛根芩連湯對(duì)小鼠小腸炭末推進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中,超微飲片是傳統(tǒng)