三維凝膠芯片技術(shù)的改進(jìn)及用于孤獨(dú)癥候選基因的相關(guān)性研究.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的完成，研究重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)入基因的功能、多樣性等研究中，目的是發(fā)展基于基因的個(gè)體化醫(yī)療，使得HGP能真正地造福于人類。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記，由于其數(shù)量大、分布廣、基因組中高度穩(wěn)定，具有廣闊的應(yīng)用前景，在基因的定位、連鎖分析、疾病易感性和藥物基因組學(xué)等研究中廣泛應(yīng)用，SNP的研究已成為人類后基因組時(shí)代的主要內(nèi)容之一。近年來(lái)，人們發(fā)展了許多SNP檢測(cè)方法，并致力于提高通量、特異性、靈敏度，及降低成本。目前高通量的

2、檢測(cè)方法大都用于多位點(diǎn)的SNP檢測(cè)，而對(duì)于尋找復(fù)雜疾病易感基因的研究、藥物基因組研究等，需要SNP作為遺傳標(biāo)記在成百上千的大樣本中進(jìn)行分型。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)發(fā)展了基于雙色熒光雜交的樣本芯片技術(shù)，適于大樣本的SNP檢測(cè)。該方法建立在二維芯片的基礎(chǔ)上，存在固定量和雜交效率低的缺陷，需要對(duì)大量的PCR產(chǎn)物純化和濃縮，因此該方法耗時(shí)、耗力，還增加了樣本DNA的消耗量和PCR產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。
　　 孤獨(dú)癥(Autism)是一種嚴(yán)重的廣泛發(fā)育障

3、礙性疾病，以社會(huì)交往障礙、興趣與活動(dòng)內(nèi)容局限、刻板和重復(fù)行為為特征，慢性病程，預(yù)后較差，不僅給患者本人造成終身的痛苦，而且給家庭和社會(huì)造成長(zhǎng)期沉重的負(fù)擔(dān)。遺傳因素在孤獨(dú)癥發(fā)病中起著重要的作用，但致病基因還不能確定，因此，探索孤獨(dú)癥的易感基因，對(duì)于疾病的預(yù)防、診斷和預(yù)后有重大意義。
　　 本文目的是要在雙色熒光雜交的基礎(chǔ)上，解決目前二維芯片的缺陷，建立三維凝膠芯片，提高芯片的固定量和雜交效率，并通過(guò)優(yōu)化固定、雜交和雜交后的處理方式

4、，使得大樣本的SNP分型可以更簡(jiǎn)單、更省時(shí)、省力，而且成本低，并可用于多位點(diǎn)的SNP檢測(cè)。本文還將優(yōu)化的三維聚丙烯酰胺凝膠芯片用于孤獨(dú)癥候選基因的SNP研究上，進(jìn)行相關(guān)性分析，以尋找孤獨(dú)癥的易感基因。具體內(nèi)容如下：
　　 ⑴優(yōu)化三維聚丙烯酰胺凝膠的制備、雜交和雜交后處理方式。通過(guò)對(duì)固定所需凝膠的濃度、樣品的濃度、樣品的處理方式、固定的條件、探針的長(zhǎng)度和Tm值及雜交后處理方式等步驟的優(yōu)化，使得三維凝膠芯片用于SNP分型更快、更準(zhǔn)確

5、。
　　 ⑵三維凝膠芯片用于多位點(diǎn)、大樣本、低成本的SNP分型。通過(guò)優(yōu)化多重PCR，將多重PCR技術(shù)與三維凝膠芯片相結(jié)合，使得一次點(diǎn)樣的芯片不只限于一個(gè)位點(diǎn)的SNP分型，而是可以用于多位點(diǎn)大樣本的SNP分型，從而更省時(shí)、省力。通常檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)需要一對(duì)分別標(biāo)記Cy3和Cy5熒光素的特異探針，熒光標(biāo)記的費(fèi)用很高，對(duì)于分型一個(gè)SNP位點(diǎn)來(lái)說(shuō)占到總成本的2/3。本研究通過(guò)引入通用序列標(biāo)簽探針，不需要對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的探針都標(biāo)記熒光，從而

6、成本大幅降低。
　　 ⑶三維凝膠芯片用于孤獨(dú)癥候選基因SNP的分型。將三維聚丙烯酰胺凝膠芯片用于孤獨(dú)癥124個(gè)核心家系和120個(gè)正常對(duì)照的9個(gè)候選基因的29個(gè)SNPs的分型，分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　 ⑷孤獨(dú)癥候選基因的相關(guān)性研究。對(duì)9個(gè)孤獨(dú)癥候選基因包含29個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性研究，運(yùn)用SHEsis軟件和UNPHASED軟件對(duì)124個(gè)孤獨(dú)癥的核心家系和120正常對(duì)照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析內(nèi)容包括case-control的

7、相關(guān)性分析和基于核心家系TDT的相關(guān)性分析，既進(jìn)行了單位點(diǎn)的分析，還包括了多位點(diǎn)組合的單倍型分析。幾種分析結(jié)果都顯示BDNF基因與孤獨(dú)癥具有顯著相關(guān)性(p＜0.01)，另外GABRA5基因和GABRB3基因也與孤獨(dú)癥相關(guān)(p＜0.05)。
　　 我們根據(jù)臨床特征分組，進(jìn)行組內(nèi)各個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)的相關(guān)性研究，包括單位點(diǎn)和單倍型的分析，又發(fā)現(xiàn)更多有意義的相關(guān)性資料，雖然不能肯定與孤獨(dú)癥相關(guān)，但至少可以反映出與孤獨(dú)癥的某些臨床癥狀相關(guān)。