應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)篩檢抗HBV活性中藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：乙型肝炎是威脅人類健康的一種嚴(yán)重疾病，乙肝病毒（HBV）的感染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，全球慢性HBV感染者約3.5億。我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，僅HBV攜帶者就達(dá)1.2億，其中慢性乙型肝炎患者有3000萬(wàn)以上，但至今尚未取得治療上的根本突破。盡管已有干擾素及核苷類等抗HBV藥物，但長(zhǎng)期應(yīng)用可引起病毒耐藥，再度活躍病毒復(fù)制等諸多副反應(yīng)。因此，尋找安全有效的抗HBV藥物已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界一項(xiàng)重要任務(wù)。近年來(lái)，中草藥抗HBV已成為國(guó)內(nèi)外的研

2、究熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乙型肝炎主要是由于濕熱之毒蘊(yùn)積于肝所致，在治療上當(dāng)以清熱解毒，疏肝利濕，健脾為主。諸多研究發(fā)現(xiàn)中藥在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝方面有明顯的臨床效應(yīng)。本課題采用HBV基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2.117細(xì)胞模型篩檢單味中藥半枝蓮、珍珠草、女貞子和青蒿抑制HBsAg、HBeAg和HBV DNA的作用，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療肝病提供參考依據(jù)。
　　 方法：HepG2.117細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，用0.25％胰酶消化

3、，配成濃度1×105個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，置37℃含5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)，用DMEM完全培養(yǎng)基換液，3-4d后，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為9個(gè)組，含8個(gè)藥物組和1個(gè)空白對(duì)照組，其中，8個(gè)藥物組中含有4個(gè)單味中藥組、2個(gè)復(fù)方藥物組和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組。單味中藥分別為半枝蓮、珍珠草、女貞子和青蒿；復(fù)方藥物分別為枝蓮清肝膠囊和枝蓮清肝膠囊加拉米夫定；陽(yáng)性對(duì)照藥物分別為拉米夫定和苦參素。實(shí)驗(yàn)的每個(gè)組都設(shè)

4、3個(gè)平行孔，藥物組用含藥的培養(yǎng)基換液，空白對(duì)照組用DMEM完全培養(yǎng)基換液，每24h換1次，分別于用藥24h、48h、72h后收取細(xì)胞上清液，置-20℃保存?zhèn)錅y(cè)。采用Sargent JM等[6]建立的四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色分析法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的水平，采用熒光定量PCR法檢測(cè)上清液HBV DNA的水平，從而評(píng)價(jià)藥物的抗HBV作用。
　　 應(yīng)用

5、SASV8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：MTT比色OD值比較，藥物組與對(duì)照組間差異均無(wú)顯著性，提示所選濃度藥物對(duì)HepG2.117細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒性作用。ELISA比色OD值比較，單味中藥組中，半枝蓮、珍珠草、女貞子與空白對(duì)照組HBsAg、HBeAg比較差異有顯著性（P<0.05）；復(fù)方藥物組中，枝蓮清肝膠囊和枝蓮清肝膠囊加拉米夫定與空白對(duì)照組HBsAg

6、、HBeAg比較差異有顯著性（P<0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組中，拉米夫定和苦參素與空白對(duì)照組比較均有顯著性差異（P<0.05）；而青蒿組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。HBsAg比較，單昧中藥中，半枝蓮在24h和72h時(shí)抑制率最高，分別為27.98％和33.97％，珍珠草在48h時(shí)抑制率最高，為13.81％；復(fù)方藥物中，枝蓮清肝膠囊在24h和72h時(shí)抑制率最高，分別為30.05％和36.26％，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定在48h時(shí)

7、抑制率最高，為24.69％；陽(yáng)性對(duì)照中，拉米夫定在24h、48h和72h時(shí)抑制率均是最高，分別為35.75％、21.05％和40.08％。HBeAg比較，單味中藥中，半枝蓮在48h和72h時(shí)抑制率最高，分別為13.16％和23.48％，珍珠草在24h時(shí)抑制率最高，為5.77％；復(fù)方藥物中，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定在24h、48h和72h時(shí)抑制率均是最高，分別為14.10％、11.58％和28.34％；陽(yáng)性對(duì)照藥物中，拉米夫定在24h、48

8、h和72h時(shí)抑制率均是最高，分別為10.26％、13.68％和28.74％。HBV DNA比較，除青蒿組外，其他各實(shí)驗(yàn)藥物組與空白對(duì)照組比較均有顯著性差異（P<0.05），其中單味中藥組中，半枝蓮的抑制率最高，為31.36％；復(fù)方藥物組中，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定的抑制率最高，為42.01％；陽(yáng)性對(duì)照藥物組中，拉米夫定的抑制率最高，為43.42％。
　　 結(jié)論：在1mg/ml濃度下，半枝蓮、珍珠草、女貞子三種單味中藥均有抑制HBV