MEKK3在TNF-α刺激后惡性腫瘤細胞產(chǎn)生IL-6作用中的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤是危害人類健康和生命的頭號殺手，許多細胞因子與惡性腫瘤密切相關。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞自身分泌或接受致炎因子(TNF-a等)刺激后產(chǎn)生的細胞因子IL-6，與惡性腫瘤的發(fā)塵發(fā)展、侵襲轉移及化療抵抗作用等預后不良密切相關。在查閱大量文獻和原有工作的基礎上，本研究應用RNA干涉(siRNA)、基因克隆、基因轉染、Western-blot、熒光實時定量PCR、RT-PCR和ELISA技術，探討有絲分裂原激活的蛋白激酶MEKK3在TNF-

2、a刺激后的惡性腫瘤細胞所產(chǎn)生的IL-6中的作用，旨在為闡明惡性腫瘤細胞中TNF-a介導的IL-6產(chǎn)生的機制和發(fā)現(xiàn)可能的治療藥物作用的靶點奠定基礎。肺癌是高度惡性的腫瘤，其死亡率占惡性腫瘤的第一位；乳腺癌是世界各地女性中最為常見的惡性腫瘤，也是導致女性死亡的主要原因之一。因此，本課題選擇肺癌和乳腺癌細胞進行研究。
　　 第一部分首先應用ELISA方法檢測肺癌A549細胞和乳腺癌MDA-MB-231細胞接受TNF-a刺激后IL-6的

3、產(chǎn)生。結果表明：在接受TNF-a刺激后，A549細胞和MDA-MB-231細胞均能產(chǎn)生較高水平的IL-6。在此基礎上，應用Western-blot和RT-PCR方法分別檢測了A549細胞和MDA-MB-231細胞接受TNF-a刺激后MEKK3的磷酸化及MEKK3基因表達的改變，以判斷其是否是TNF-a信號途徑的成分。Western-blot結果表明：A549細胞接受TNF-a刺激后10min，MEKK3即發(fā)生磷酸化，30min達高峰，2

4、h后恢復正常；MDA-MB-231細胞接受TNF-a刺激后30min發(fā)生磷酸化，1h達高峰，2h后亦恢復正常。RT-PCR結果顯示：與未刺激的樣本對比，兩種細胞接受TNF-a刺激后，MEKK3 mRNA表達均明顯增加。Western-blot結果和RT-PCR結果均表明：MEKK3可被TNF-a激活、MEKK3是TNF-a信號途徑的信號分子，其接受TNF-a刺激后磷酸化的出現(xiàn)與改變及其mRNA表達的改變相似于文獻報道的其他蛋白激酶因接受

5、細胞因子刺激而活化后的磷酸化和基因表達的改變。
　　 第二部分應用Ambion公司siRNA設計軟件設計針對MEKK3基因4個不同部位siRNA靶點的模板DNA序列，在體外合成相應的DNA片段后，以BamHI及HindⅢ酶切位點分別克隆入pSilencer4.1-CMV hygro載體，構建成四個針對MEKK3基因的siRNA表達載體-pSilencer4.1-MEKK3siRNA，再以脂質體(Lipofectamine2000

6、)分別將其轉染入A549細胞，應用Western-blot檢測MEKK3 siRNA表達載體對MEKK3表達的抑制。結果發(fā)現(xiàn)，四個MEKK3 siRNA表達載體對MEKK3的表達均有抑制作用，其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制作用最為顯著，抑制率達84％，因此選擇將其分別轉染入A549和MDA-MB-231細胞，潮霉素篩選后獲得的抗性細胞克隆株，經(jīng)熒光實時定量PCR測定后，結果顯示MEKK3 siRNA2/A5

7、49和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定克隆株中MEKK3的表達均獲得了80％以上的抑制，保證了后續(xù)的研究。
　　 第三部分首先應用RT-PCR，擴增MEKK3基因的全長cDNA序列，通過KpnI和XhoI酶切位點克隆入pcDNA3.1/hygro(+)載體中，構建pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表達載體，并轉染入A549和MDA-MB-231細胞中。Western-blot結果顯示MEKK3蛋

8、白在此兩種細胞中均表達良好。應用潮霉素篩選獲得的兩種細胞的穩(wěn)定細胞克隆株，經(jīng)熒光實時定量PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，其MEKK3 mRNA的表達水平與空載體穩(wěn)定細胞克隆株相比，均有顯著增加(分別增加了195％和177％)。結果表明pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表達載體構建成功，且成功地獲得了MEKK3高表達穩(wěn)定細胞克隆株，進一步保證了后續(xù)的研究。
　　 第四部分分別應用RT-PCR和ELISA檢測TNF-a刺激未轉染的

9、A549和MDA-MB-231細胞(野生株)、MEKK3低表達的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定細胞克隆株、將MEKK3基因重新轉染入MEKK3低表達的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231并經(jīng)RT-PCR驗證恢復了MEKK3表達的細胞、A549和MDA-MB-231siRNA陰性對照穩(wěn)定細胞克隆株、MEKK3高表達的穩(wěn)定克隆株及pcDNA

10、3.1空載體穩(wěn)定細胞克隆株中IL-6的表達或產(chǎn)生。結果表明：MEKK3低表達的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定細胞克隆株IL-6 mRNA的表達及IL-6的產(chǎn)生均明顯低于野生株或陰性對照克隆株，差異非常顯著(P均＜0.01)；此兩細胞株恢復MEKK3表達后，其IL-6mRNA的表達和IL-6的產(chǎn)生均獲得了大幅度的提高，其結果高于野生株或陰性對照克隆株，差異非常顯著(P均＜0.01)；

11、A549和MDA-MB-231 MEKK3高表達穩(wěn)定細胞克隆株接受TNF-a刺激后，其IL-6的產(chǎn)生均明顯高于兩者的野生株或空載體對照株，差異非常顯著(P＜0.01)。
　　 初步結果提示：MEKK3是TNF-a介導的肺癌和乳腺癌細胞中IL-6產(chǎn)生的信號轉導途徑的重要成分，MEKK3與TNF-a介導的肺癌和乳腺癌細胞中IL-6的產(chǎn)生密切相關，并在TNF-a介導的肺癌和乳腺癌細胞產(chǎn)生IL-6中起重要的調控作用，其下游信號途徑有待進