構(gòu)建在活體小動(dòng)物示蹤細(xì)胞周期G1期的光學(xué)分子報(bào)告基因.pdf

1、背景與目的:人類很多疾病特別是惡性腫瘤都與細(xì)胞周期的非正常激活有關(guān)。很多抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)是控制細(xì)胞周期的關(guān)鍵酶,通過抑制酶的活性,阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性凋亡。細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程,包含G1期、S期、G2期、M期。CyclinE在G1期表達(dá),S期降解,通過激活CDK2促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期,G1/S過渡期是最重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn),決定細(xì)胞開始第一輪增殖、分化、死亡或者退出細(xì)胞周期進(jìn)入G0期

2、。光學(xué)分子影像技術(shù)是應(yīng)用光學(xué)成像在分子或細(xì)胞水平上研究活體狀態(tài)下的生理,本研究旨在構(gòu)建反映細(xì)胞周期G1期融合報(bào)告基因,實(shí)現(xiàn)利用生物發(fā)光成像技術(shù)無創(chuàng)地在活體檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　材料和方法:利用cyclinE細(xì)胞周期依賴性變化和泛素化依賴性降解的特性,利用熒光素酶基因能夠應(yīng)用于活體動(dòng)物這一特點(diǎn),以融合蛋白技術(shù)構(gòu)建CyclinE-luc基因真核表達(dá)重組載體,通過共轉(zhuǎn)染方法建立穩(wěn)定表達(dá)CyclinE-luc的腫瘤細(xì)胞株。采用細(xì)胞周期

3、同步化法檢測(cè)CyclinE-luc的表達(dá)是否依細(xì)胞周期而調(diào)節(jié);采用siRNA干擾及蛋白酶體抑制實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證CyclinE-luc的泛素化依賴性降解途徑;采用載體成像的方法來檢測(cè)CyclinE-luc是否可以在體監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的變化;采用免疫組化的方法來驗(yàn)證細(xì)胞是否受抗腫瘤藥物影響。
　　結(jié)果:CyclinE-luc的表達(dá)水平隨細(xì)胞周期變化而變化,在G1期達(dá)到最高點(diǎn)。CyclinE-luc在敲出Fbw7及抑制蛋白酶體后積累明顯增加。Cy