磷酸鈣生物陶瓷骨誘導過程中細胞基因表達的研究.pdf

1、多孔磷酸鈣生物陶瓷不僅具有良好的生物相容性，在一定條件下還表現(xiàn)出骨誘導性，即不用外加生長因子或活體細胞可以在非骨部位誘導骨組織形成，在治療骨缺損等方面中具有光明的應用前景。 已有研究表明多孔磷酸鈣具有骨誘導性的材料學因素主要包括(1)多孔結構； (2)相組成； (3)結晶度和力學性能等。前期動物植入實驗結果表明多孔雙相陶瓷在體內具有較強的成骨誘導能力，因此本論文實驗主要采用多孔的HA/TCP雙相陶瓷。 在骨誘導機理研究中

2、，對于材料誘導的靶向細胞一直是猜測和假設骨髓基質細胞或在植入部位出現(xiàn)的未分化的血管末梢干細胞，然而缺乏直接的體內和體外數(shù)據(jù)證明，間充質細胞的來源問題需要進一步研究。另外，在干細胞向成骨細胞分化過程中大量的基因參與表達，從材料——基因表達的關系進行看，鈣磷材料可以誘導細胞內控制成骨發(fā)育的關鍵基因在細胞中的上調表達嗎?哪些不同的材料學因素影響這些基因的表達?這些問題構成了本論文的研究內容。 在磷酸鈣材料的骨誘導過程中，處于未分化的間

3、充質干細胞、定向的基質干細胞、早期骨祖細胞、后期骨祖細胞、前成骨細胞到成骨細胞等，都可能是磷酸鈣陶瓷材料誘導的靶向細胞。本文主要采用了成骨細胞、骨髓基質細胞、骨骼肌母細胞等可以向骨細胞分化的細胞類型研究了磷酸鈣陶瓷骨誘導過程中對細胞的誘導分化作用，并從分子生物學水平提供了骨誘導的證據(jù)。 首先，研究了多孔磷酸鈣陶瓷體外對原代培養(yǎng)的骨髓基質細胞的誘導作用。多孔磷酸鈣陶瓷在植入狗的非骨部位一定時間后組織學觀察可以在陶瓷的孔隙中形成骨組

4、織，因此，抽取小鼠骨髓，分離培養(yǎng)原代的骨髓基質細胞，體外與各種多孔的磷酸鈣陶瓷材料復合培養(yǎng)，研究其對原代細胞的誘導作用。 如果能觀察到多孔磷酸鈣陶瓷對分離培養(yǎng)的骨髓基質細胞起到骨誘導作用，即骨髓基質細胞為骨誘導過程中的靶向細胞，那么在培養(yǎng)一定時間后應該可以觀察到骨組織的形成。為驗證這一假設，設計了擴散盒模型，即多孔磷酸鈣陶瓷與分離培養(yǎng)的大鼠骨髓基質細胞一起裝入到擴散盒中，然后植入到動物肌肉中，以屏蔽宿主的自身細胞，利用動物自身的

5、血液循環(huán)和營養(yǎng)環(huán)境，植入一定時間后，觀察其成骨情況。在植入半年后，組織學切片觀察到多孔陶瓷孔隙里面已形成骨組織，證實了這一假設，進一步為鈣磷陶瓷的骨誘導性提供直接證據(jù)。其次，體外培養(yǎng)研究了磷酸鈣陶瓷材料的材料學因素對成骨細胞骨誘導過程中細胞的生長、增殖、骨相關基因的表達等。體外培養(yǎng)情況下，細胞通常是生長在材料的表面上，因此，以多孔磷酸鈣陶瓷形成類骨磷灰石層后為研究材料，研究材料表面形貌變化對成骨細胞的影響；同時，由于不同相成份和不同燒結

6、溫度下的磷酸鈣陶瓷在培養(yǎng)基中的溶解性不一樣，對細胞的影響也不一樣，故同時還采用了多種不同相成份和燒結溫度的磷酸鈣陶瓷材料。結果表明鈣磷陶瓷不同的相成份和燒結溫度能夠影響骨相關基因的表達，其表面形成類骨磷灰石層后能促進成骨細胞對骨鈣素和Ⅰ型膠原基因的表達。 最后，由于肌肉組織中也存在大量的多能干細胞類型，因此以骨骼肌母細胞(C2C12系)為細胞模型，我們研究了多孔磷酸鈣陶瓷對肌母細胞的骨誘導過程中骨特異基因的表達情況。多孔磷酸鈣陶

7、瓷在骨誘導過程中，即骨的形成過程中，同時伴隨著細胞的成骨定向分化及骨相關基因(Cbfal，OCN，Type Ⅰ collagen，Ostcopontin等等)的表達。Cbfal為多能干細胞向成骨細胞分化的關鍵調控因子，通過進一步定量研究多孔磷酸鈣陶瓷對骨骼肌母細胞骨誘導過程中Cbfal和OCN基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，骨誘導過程中伴隨著干細胞的這一分化過程，Cbfal，這一關鍵基因被激活并高效表達，從而引起細胞進一步分化，出現(xiàn)確定成骨細胞功能