高溫高濕下GmBLH4參與春大豆種子田間劣變抗性的分子機(jī)制研究.pdf

1、大豆(Glycine max(L.) Merr.)是重要的油料作物，也是我國的戰(zhàn)略性物資，在我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和民族種業(yè)發(fā)展中占有重要地位。我國南方春大豆種子生理成熟期往往會遇到高溫多雨的夏季，導(dǎo)致種子發(fā)生田間劣變，嚴(yán)重影響了春大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物轉(zhuǎn)錄因子(如TALE家族的兩個成員KNOTTED-likehomeobox(KNOX)和BELl-like homeobox(BELL or BLH))在植物生長發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫

2、過程中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆KNOX家族成員GmSBH1能夠參與調(diào)控植株的幼苗形態(tài)建成、生長發(fā)育以及種子田間劣變抗性過程。本文擬以田間劣變抗性品種湘豆3號的大豆種子為材料，構(gòu)建高溫高濕酵母雙雜交cDNA文庫;以GmSBH1蛋白為誘餌，篩選出15個與種子田間劣變相關(guān)的互作蛋白;利用GST pull-down和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)分別從體外和體內(nèi)驗(yàn)證大豆BELL家族轉(zhuǎn)錄因子GmBLH4與GmSBH1的互作關(guān)系;通

3、過系統(tǒng)進(jìn)化分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析初步明確了BELL家族在大豆發(fā)育過程中的作用和進(jìn)化特點(diǎn);利用熒光定量、亞細(xì)胞定位、啟動子分析以及轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等技術(shù)闡明了GmBLH4基因參與植物形態(tài)建成以及種子田間劣變過程，為大豆TALE家族參與種子田間劣變抗性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、以田間劣變抗性品種湘豆3號為材料，采用同源重組的方法，構(gòu)建大豆生理成熟期(R7期)高溫高濕(40±2℃/30±2℃、相對濕度95

4、±5％晝/70±5％夜、10h晝/14 h夜)酵母雙雜交cDNA文庫，文庫多樣性和均一性均較好，文庫效率大于1.0×106，適合用于蛋白與蛋白之間相互作用的大規(guī)模篩選。
　　2、以實(shí)驗(yàn)室前期分離并鑒定的種子田間劣變相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmSBH1為誘餌蛋白，與1中的酵母cDNA文庫進(jìn)行雙雜交，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-gal染色共篩選到49個陽性克隆;提取49個陽性克隆的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)繁后進(jìn)行測序和比對，得到15個可能與GmSBH

5、1互作的蛋白;利用NCBI數(shù)據(jù)庫和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫檢索15個互作蛋白的功能，分別為種子成熟蛋白、種子貯藏蛋白、發(fā)育相關(guān)蛋白、蛋白酶抑制劑和功能未知蛋白。
　　3、從15個互作蛋白中挑選植物發(fā)育相關(guān)基因BEL1-LIKE HOMEODOMAIN4(GmBLH4)，進(jìn)化樹分析表明大豆基因組中含有34個BELL家族基因，并且發(fā)現(xiàn)GmBLH4和擬南芥中的BLH4(SAW2)同源性較高;基因表達(dá)譜分析顯示GmBELLs在大豆葉片、根

6、、莖、花、莢、根瘤、根毛、種子和頂端分生組織(SAM)中差異表達(dá);根據(jù)NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫提交的GmBLH4的CDS序列，從大豆cDNA中分離出其完整編碼區(qū)域，序列分析顯示該基因的ORF全長2022bp，編碼674個氨基酸;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示其蛋白包含SKY結(jié)構(gòu)域、典型的BEL保守域結(jié)構(gòu)以及Homeodomain結(jié)構(gòu)域;SignalP網(wǎng)站預(yù)測顯示GmBLH4不具有信號肽;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，GmBLH4序列存在α-螺旋(3

7、8.58％)、β-轉(zhuǎn)角(6.68％)、延伸鏈(10.39％)和無規(guī)卷曲(44.36％);基于煙草表皮細(xì)胞和大豆原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位表明，GmBLH4定位于細(xì)胞核中。
　　4、利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)和GST pull-down以及Western blot技術(shù)驗(yàn)證，無論體內(nèi)還是體外GmBLH4蛋白都能特異地結(jié)合GmSBH1蛋白。
　　5、GmBLH4與GmSBH1互作關(guān)系與特點(diǎn)的研究結(jié)果表明，GmSBH1

8、的保守結(jié)構(gòu)域MEINOX(KNOX1和KNOX2)和Homeodomain都能夠結(jié)合GmBLH4蛋白，但是GmSBH1編碼區(qū)完整存在時的活性最高;GmBLH4蛋白中N端（包含SKY和BEL結(jié)構(gòu)域）和C端(Homeodomain結(jié)構(gòu)域)也有利于其結(jié)合GmSBH1蛋白。以上結(jié)果說明TALE家族的保守域?qū)τ贙NOX/BELL二聚體的形成很重要。
　　6、GmBLH4基因在大豆中的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，無論是抗性品種湘豆3號還是不抗品種

9、寧鎮(zhèn)1號，GmBLH4基因均在花中表達(dá)量最高，根中次之，種子表達(dá)量最低。啟動子驅(qū)動下的GUS基因染色結(jié)果顯示，GmBLH4在擬南芥的花、幼苗的根和頂端分生組織中高表達(dá)，在莢、成熟葉片及種子中不表達(dá)。高溫高濕脅迫下，GmBLH4基因在寧鎮(zhèn)1號中脅迫處理48h后顯著上調(diào)表達(dá)，而在湘豆3號中處理168 h后表達(dá)才能達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說明GmBLH4基因可能參與調(diào)控大豆頂端分生組織和花器官的生長發(fā)育，同時也可能參與春大豆種子田間劣變過程。<

10、br>　　7、異源表達(dá)結(jié)果表明，GmBLH4基因過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片卷曲、角果變短以及產(chǎn)量降低等。石蠟切片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株葉片的細(xì)胞排列松散、細(xì)胞間隙較大，柵欄細(xì)胞變短變細(xì)，海綿細(xì)胞分布不規(guī)則，近、遠(yuǎn)軸細(xì)胞尤其是遠(yuǎn)軸細(xì)胞變得更小、排列更加緊密。轉(zhuǎn)GmBLH4基因株系經(jīng)高溫高濕脅迫后，種子發(fā)芽率和生活力明顯高于野生型和突變體blh4植株，與轉(zhuǎn)GmSBH1基因株系種子的耐逆性相當(dāng)。以上結(jié)果表明GmBLH4能夠與GmSBH1形成異源二聚體，