超微粉腧穴敷貼對變應(yīng)性鼻炎大鼠Th細(xì)胞亞群的調(diào)控.pdf

1、研究目的:腧穴敷貼治療變應(yīng)性鼻炎因其在臨床的廣泛應(yīng)用及確切的療效，相關(guān)的效應(yīng)及機(jī)制探討已成為近年的研究熱點，并取得了一定的研究成果。根據(jù)腧穴敷貼治療變應(yīng)性鼻炎計量學(xué)和Meta分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，既往的研究雖然肯定了其臨床療效，但高質(zhì)量的文獻(xiàn)很少。機(jī)理研究有涉及AR發(fā)病機(jī)制中Th細(xì)胞亞群Th1/Th2的失衡關(guān)系，但并不深入，缺乏對近年免疫研究熱點Th細(xì)胞另外兩個亞群，Treg細(xì)胞和Th17的相關(guān)研究。目前臨床使用的腧穴敷貼藥物為中藥散劑，存在

2、藥粉顆粒大小不一，很難混合均勻，透皮吸收率低，影響貼敷效果的問題。因此，本研究擬從兩個方面進(jìn)行:一是采用細(xì)胞破壁，生物利用率高，能充分混勻且利于吸收的中藥超微粉來進(jìn)行腧穴敷貼，選取大椎、肺俞、腎俞穴治療變應(yīng)性鼻炎大鼠并觀察其療效;二是探尋超微粉治療AR的可能機(jī)制，尤其是在既往研究的基礎(chǔ)上深入探討超微粉腧穴敷貼治療對AR大鼠Th1、Th2、Treg和Th17細(xì)胞亞群的可能影響，以及細(xì)胞亞群之間的相互作用。
　　 方法:造模與分組:

3、全部56只SD大鼠，雄性28只，雌性28只，2月齡。雌雄分籠喂養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)字表原則分成兩組:正常對照組10只（雄5，雌5）;造模組46只(雄23，雌23)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，造模組46只大鼠予卵清蛋白10mg+Al(OH)3粉末30mg+生理鹽水1ml制成混懸液腹腔內(nèi)注射，隔日1次，共7次，作為基礎(chǔ)致敏。第15天開始加強(qiáng)免疫，予5％OVA50ul噴鼻/（側(cè)·日）和1％OVA噴霧吸入5min，連續(xù)7天。3周后，造模組46只大鼠中，有6只死

4、于造模過程中（雄2只，雌4只），考慮為腹腔注射誤注入大腸所致。剩余40只大鼠在末次激發(fā)后30min觀察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為，并采用疊加計分法進(jìn)行行為學(xué)評分，所有大鼠評分均超過5分，顯示本組造模全部成功。將造模成功的AR模型大鼠再按隨機(jī)數(shù)字表原則隨機(jī)分為4組:模型組10只（雄6只，雌4只）;丙酸氟替卡松噴鼻劑組10只（雄5只，雌5只）;普通粉組10只（雄5只，雌5只）;超微粉組10只（雄5只，雌5只）。以上5組50只大鼠進(jìn)入下一步實

5、驗。
　　 穴位定位:大鼠大椎、肺俞、腎俞定位參考《常用實驗動物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間。腎俞位于第2腰椎下兩旁。
　　 普通粉以及超微粉的制備:普通粉、超微粉均選用符合《中華人民共和國藥典》(2005版)中藥飲片炮制規(guī)范，中藥廣州致信中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號為080710。①普通粉:白芥子粉、延胡索粉、細(xì)辛粉、生甘遂粉，按照2∶2:1:1的比例配置;②超微粉:將按

6、比例配置好的普通粉由廣東省第二中醫(yī)院藥劑科使用微粉機(jī)，振動電機(jī)功率為1.5FW，加工15分鐘，粉碎成粒徑范圍0.1～75μm，粒度分布中心D50≈10～15μm，達(dá)300目以上的超微粉。
　　 實驗措施:①正常對照組:不采取任何處理措施;②模型組:給予生理鹽水滴鼻，每日1次×10天;③丙酸氟替卡松組:丙酸氟替卡松鼻噴霧劑噴鼻，每日1次，每次50μg/側(cè)×10天;④普通粉組:首先進(jìn)行備皮，將按比例配置好的普通粉與新鮮姜汁調(diào)和均勻，

7、制成約0.5cm×0.5cm大小的藥塊，用3cm×3cm一次性紙膠布固定于穴位，再使用一次性透氣孔膠布纏繞1-2圈以加固藥貼。每次貼藥4h×10天;⑤超微粉組:貼敷藥物改為超微粉，方法同上。
　　 實驗觀察指標(biāo)與檢測:
　　 ①行為學(xué)觀察:于末次治療后30min觀察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為的變化。記分方法:鼻癢:輕度搔癢1-2次為1分，劇烈搔癢抓鼻四周2分。噴嚏:1-3個為1分，4-10個為2分;11個以上為3分。清涕

8、:流至鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。采用疊加計分法。
　　 ②鼻黏膜組織HE染色及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)觀察:將各組大鼠于末次相關(guān)處理后，在10％水合氯醛，3ml/kg麻醉后，斷頭處死大鼠，迅速剝除上頜骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中分離出來，打開鼻背，沿鼻中線切開，暴露鼻中隔和雙側(cè)鼻腔，分離鼻中隔與鼻黏膜，取雙側(cè)鼻黏膜。放入10％甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片行蘇木精—伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀測實驗大鼠鼻黏膜組織學(xué)改變

9、。每張病理切片隨機(jī)選取5個高倍視野(10×40)計數(shù)，每只大鼠鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)作為一個計數(shù)。
　　 ③透射電子顯微鏡觀察:鼻黏膜離體后必須在2分鐘內(nèi)，將標(biāo)本置入2.5％戊二醛液中，4℃冰箱過夜。固定后的標(biāo)本用磷酸緩沖液沖洗，并浸泡過夜。1％鋨酸緩沖液固定1h，梯度乙醇脫水，Epon812包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，用日立JEM1200-EX透射電子顯微鏡觀察。
　　 ④免疫學(xué)指標(biāo)測定:按照試

10、劑盒說明采用酶聯(lián)免疫法，檢測血清中IL-4、TGF-β1、IFN-γ、IL-17的含量。
　　 統(tǒng)計方法:行為學(xué)改變采用等級資料Kruskal-Wallis多個獨立樣本非參數(shù)檢驗，嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及血清IFN-γ、IL-4，TGF-β1，IL-17采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:行為學(xué)觀察結(jié)果:①模型組與正常對照組在鼻癢、噴嚏、清涕等記分相

11、比，分差顯著，說明應(yīng)用卵清蛋白致敏建立的AR動物模型成功;②由于非參數(shù)檢驗不能做多重比較，從平均秩次看三種治療手段均有效，超微粉組從評分看治療效果最好，丙酸氟替卡松次之，普通粉效果稍差，說明超微粉、普通粉和丙酸倍氯米松鼻噴霧劑均能明顯改善變應(yīng)性鼻炎的鼻癢、噴嚏、清涕等癥狀，使變應(yīng)性鼻炎大鼠癥狀得以大部或部分恢復(fù)。
　　 嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)結(jié)果:模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組EOS計數(shù)較模型組及普通粉組顯著下降(

12、P＜0.01)，較丙酸氟替卡松組亦顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.539)，提示超微粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎局部療效肯定;丙酸氟替卡松組及普通粉組EOS計數(shù)較模型組均明顯下降(P＜0.05)，丙酸氟替卡松組EOS計數(shù)較普通粉組明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），提示普通粉治療變應(yīng)性鼻炎效果不如鼻內(nèi)激素。
　　 HE染色圖片分析表明:模型組與正常對照組比較炎癥反應(yīng)明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張、鼻黏膜上皮腫脹，

13、滲透性增強(qiáng)，有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤固有層和血管周圍，說明變應(yīng)性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預(yù)的三組與模型組比較均很大程度的減輕了炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)在上皮無明顯腫脹，毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯，滲透性減少，以及無或者少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤固有層和血管周圍，說明藥物干預(yù)組的治療均達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，可以緩解變應(yīng)性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應(yīng)。從三組圖片結(jié)果看同EOS計數(shù)結(jié)果相似:丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組，但從HE染色的圖片分析，丙酸氟替卡松組

14、和超微粉組差異不大。
　　 透射電子顯微鏡結(jié)果:模型組與正常對照組比較炎癥反應(yīng)明顯，粘膜表面不完整，纖毛稀松畸形，見粗短纖毛、微絨毛，部分脫落，纖毛根部連接不完整，細(xì)胞內(nèi)見腫脹線粒體及大小不等空泡，部分線粒體脊丟失，說明變應(yīng)性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預(yù)的三組與模型組比較均有明顯所改善，表現(xiàn)在粘膜表面基本完整，纖毛、微絨毛數(shù)量較模型組明顯增多，細(xì)胞連接正常，超微粉組細(xì)胞內(nèi)甚至可見正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，接近正常對照組的圖片。說明藥

15、物干預(yù)組的治療都達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，可以緩解變應(yīng)性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應(yīng)。從三組圖片結(jié)果看同EOS計數(shù)及HE染色結(jié)果相似:丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組，但與HE染色略微有差異的是超微粉組的透射電子顯微鏡圖片可見細(xì)胞內(nèi)正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，更接近于正常對照組的圖片結(jié)果，療效較丙酸氟替卡松組更好。
　　 血清學(xué)觀察結(jié)果:IFN-γ模型組較正常對照組大幅降低，提示造模成功，超微粉組IFN-γ較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松

16、組顯著升高(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.584），丙酸氟替卡松組較模型組含量升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.179)，綜合分析結(jié)果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著升高了過敏導(dǎo)致的血清IFN-γ異常降低，同時超微粉效果最好，普通粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。
　　 IL-4模型

17、組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組IL-4較模型組、普通粉組顯著降低(P＜0.05)，與正常對照組及丙酸氟替卡松組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.095、0.07)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝O.396)，綜合分析結(jié)果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著降低了過敏導(dǎo)致的血

18、清IL-4異常升高，同時超微粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。
　　 TGF-β1模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組TGF-β1較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.05)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.993)，綜合分析結(jié)果提

19、示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均顯著降低了過敏導(dǎo)致的血清TGF-β1異常升高，同時超微粉效果最好，普通粉與鼻內(nèi)激素效果相當(dāng)。
　　 IL-17模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組IL-17較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.903)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學(xué)差

20、異(P＜0.05)，丙酸氟替卡松組較普通粉組IL-17升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.01)，綜合分析結(jié)果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應(yīng)性鼻炎均降低了過敏導(dǎo)致的血清IL-17異常升高，同時超微粉效果最好，鼻內(nèi)激素次之，普通粉稍差。
　　 結(jié)論:造模后AR大鼠行為學(xué)評分均超過5分，說明卵清蛋白腹腔注射是一種可靠地AR造模方法。綜合EOS計數(shù)、組織HE染色、透射電鏡及血清ELISA結(jié)果:超微粉、丙酸氟替卡松、普通粉組與模