二硫化碳暴露對(duì)孕鼠子宮組織整合素和白血病抑制因子mRNA表達(dá)及DNA甲基化的影響.pdf

1、研究背景：
　　 課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎植入期CS2暴露可明顯降低胚胎植入數(shù)目，且植入數(shù)目的降低與子宮內(nèi)膜相關(guān)粘附分子蛋白表達(dá)的降低有關(guān)。特別是作為子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子的整合素ανβ3及對(duì)其表達(dá)有明顯促進(jìn)作用的白血病抑制因子(LIF)，但CS2暴露致蛋白表達(dá)明顯降低的機(jī)制尚不明確。因此探討CS2暴露下粘附分子表達(dá)降低的原因，對(duì)于揭示CS2的胚胎毒作用機(jī)制及預(yù)防和控制CS2的危害具有深遠(yuǎn)的意義。
　　 流行病學(xué)

2、研究調(diào)查顯示子宮組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)的降低可能是導(dǎo)致不孕癥的原因之一。另外有研究表明LIFmRNA表達(dá)水平的降低可能與雌（女）性著床失敗有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，外源性化合物暴露可以通過影響基因轉(zhuǎn)錄效率，即mRNA水平進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，研究在胚胎植入這個(gè)特定時(shí)期內(nèi)整合素αvβ3和LIFmRNA的表達(dá)規(guī)律及CS2暴露對(duì)其影響，對(duì)于探討CS2暴露致整合素ανβ3和LIF蛋白表達(dá)異常的可能原因、揭示CS2的胚胎毒作用機(jī)制具有重要

3、的意義。
　　 表觀遺傳是指在DNA序列沒有發(fā)生改變的前提下，基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的變化。DNA甲基化，是表觀遺傳變異的主要形式，主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的胞嘧啶上，需要甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，即DNMT)的參與。DNA甲基化同時(shí)也是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要機(jī)制，可影響基因的轉(zhuǎn)錄過程，在胚胎發(fā)育和胚胎植入過程中也起著重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可以通過調(diào)節(jié)鈣粘連蛋白和HOX10蛋白的表達(dá)來

4、影響子宮內(nèi)膜的容受性。因此，研究CS2暴露對(duì)整合素ανβ3和LIF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況的影響，闡明DNA甲基化與整合素ανβ3及LIFmRNA表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，可更深入探討CS2暴露下整合素ανβ3及LIF蛋白表達(dá)異常的原因。
　　 因此，本課題擬通過檢測(cè)胚胎植入期CS2暴露后孕鼠子宮組織整合素ανβ3和LIFmRNA表達(dá)情況，并從表觀遺傳學(xué)角度，探討CS2暴露致粘附分子相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低的原因，從而揭示CS2暴露致胚胎植入障礙

5、機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 構(gòu)建胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露CS2致胚胎植入障礙模型，觀察小鼠胚胎發(fā)育以及胚胎植入障礙現(xiàn)象，檢測(cè)不同暴露時(shí)間不同觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中整合素ανβ3、LIFmRNA表達(dá)水平，測(cè)定各觀察終點(diǎn)整合素ανβ3及LIF基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況，并檢測(cè)DNMT1mRNA表達(dá)情況，以期研究整合素ανβ3和LIF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化情況與基因表達(dá)改變的關(guān)系，從而探討整合素ανβ3、LIFmRNA

6、水平及其基因甲基化狀態(tài)在胚胎植入期CS2暴露致其蛋白表達(dá)水平降低中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.建立動(dòng)物模型
　　 SPF級(jí)性成熟KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按雌雄1∶1交配合籠，次日晨8點(diǎn)檢查陰栓，陰栓陽(yáng)性者記為孕第1天(GD1)。將孕鼠隨機(jī)分為GD3暴露的GD4、GD5、GD6、GD7觀察終點(diǎn)及其對(duì)照組，GD4暴露的GD5、GD6、GD7觀察終點(diǎn)及其對(duì)照組，GD5暴露的GD6、GD7觀察終點(diǎn)及其對(duì)照組以

7、及GD6暴露的GD7觀察終點(diǎn)及其對(duì)照組。共10個(gè)暴露組和10個(gè)對(duì)照組。分別在各個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)，按照當(dāng)日孕鼠體重以631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量對(duì)孕鼠行腹腔注射CS2一次，對(duì)照組給予橄欖油。在各個(gè)相應(yīng)觀察終點(diǎn)脫臼處死小鼠后稱取子宮、卵巢、肝、脾、腎的重量，子宮迅速稱量后，置入液氮速凍，-80℃保存，血清-20℃保存待用。
　　 2.各觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中整合素ανβ3及LIFmRNA水平的檢測(cè)應(yīng)用半定量RT-PCR方

8、法檢測(cè)胚胎植入期CS2暴露各相應(yīng)觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中整合素αvβ3及LIFmRNA水平。
　　 3.各觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中DNMT1mRNA水平的檢測(cè)應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)胚胎植入期CS2暴露各相應(yīng)觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中DNMT1mRNA表達(dá)水平。
　　 4.各觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中整合素ανβ3及LIF基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測(cè)
　　 應(yīng)用甲基化特異性PCR法(MSP)和堿性磷酸鹽直接測(cè)序法(B

9、SP)檢測(cè)整合素ανβ3及LIF基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理采用spss17.0軟件，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)各個(gè)基因mRNA相對(duì)含量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較暴露組與對(duì)照組兩組之間的差異。對(duì)于各個(gè)暴露組各基因甲基化程度的差異等計(jì)數(shù)資料，采用X2檢驗(yàn)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.胚胎植入期CS2暴露所致

10、母體毒性作用
　　 各暴露組孕鼠子宮、卵巢、肝臟、脾臟及腎臟重量與相應(yīng)的對(duì)照組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;各暴露組肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)及腎臟系數(shù)與相應(yīng)的對(duì)照組比較差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而子宮系數(shù)和卵巢系數(shù)與相應(yīng)的對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，提示胚胎植入期暴露CS2對(duì)孕鼠生殖器官有一定影響，具有一定的母體毒性。
　　 2.CS2暴露對(duì)孕鼠子宮組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)的影響孕鼠在GD3暴露于CS2后在GD4和GD

11、5觀察終點(diǎn)，子宮組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平分別較對(duì)照組降低了33.21％和35.65％(P＜0.05);孕鼠在GD4暴露于CS2后在GD5和GD6觀察終點(diǎn)，子宮組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組分別降低了44.08％和28.06％(P＜0.05);孕鼠在GD5暴露于CS2后在GD6觀察終點(diǎn)，子宮組織中整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了26.71％(P＜0.05);孕鼠在GD6暴露于CS2后在GD7觀察終點(diǎn)，子宮

12、組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了35.91％(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，孕鼠在胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2可導(dǎo)致子宮組織整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平降低。
　　 3.CS2暴露對(duì)孕鼠子宮組織LIFmRNA表達(dá)的影響
　　 孕鼠在GD3暴露于CS2后在GD4觀察終點(diǎn)，子宮組織LIFmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了35.13％(P＜0.05);孕鼠在GD4暴露于CS2后在GD5、GD6和GD7觀察終點(diǎn)

13、，子宮組織LIFmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組分別降低了39.98％，17.13％和18.11％(P＜0.05);孕鼠在GD5暴露于CS2后在GD6觀察終點(diǎn)，子宮組織LIFmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了29.92％(P＜0.05);孕鼠在GD6暴露于CS2后在GD7觀察終點(diǎn)，子宮組織LIFmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組變化不明顯(P＞0.05)。由上述結(jié)果可以看出:孕鼠在胚胎植入期暴露于CS2可以導(dǎo)致子宮組織LIFmRNA表達(dá)水平明顯降低。孕后GD

14、4胚胎植入期暴露于CS2其子宮組織LIFmRNA降低較明顯。
　　 4.CS2暴露對(duì)孕鼠子宮組織甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1mRNA表達(dá)的影響
　　 孕鼠在GD3暴露于CS2后在GD4觀察終點(diǎn)，子宮組織DNMT1mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了35.13％(P＜0.05);孕鼠在GD4暴露于CS2后在GD6觀察終點(diǎn)，子宮組織DNMT1mRNA表達(dá)水平降低了33.60％(P＜0.05)由以上結(jié)果可以推測(cè)孕鼠植入期暴露CS2可以導(dǎo)致其

15、子宮組織中DNMT1mRNA表達(dá)水平的改變。
　　 5.各個(gè)暴露組不同觀察終點(diǎn)整合素ανβ3和LIF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況
　　 采用Methprimer軟件對(duì)整合素ανβ3的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行CpG島檢測(cè)結(jié)果顯示，該區(qū)域存在一個(gè)CpG島，長(zhǎng)度為200bp，存在14個(gè)CpG位點(diǎn)。選取整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯改變的GD4組和相應(yīng)的對(duì)照組采用直接測(cè)序法(BSP)檢測(cè)樣本甲基化水平。每只孕鼠BSP挑取5條克隆測(cè)序。測(cè)序

16、結(jié)果顯示，暴露組和對(duì)照組在14個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化模式的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，采用Methprimer軟件對(duì)LIF的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行CpG島檢測(cè)，結(jié)果顯示該區(qū)域無CpG島存在。說明LIF基因發(fā)生甲基化的概率亦不大。提示本研究中孕鼠暴露于CS2后致子宮組織整合素ανβ3和LIFmRNA表達(dá)水平的改變與其基因甲基化作用的關(guān)聯(lián)性較小。
　　 結(jié)論：
　　 1.孕鼠于植入期暴露于CS2可以降低子宮組織整合素ανβ3和LIFmR

17、NA表達(dá)水平。提示mRNA水平降低可能是整合素ανβ3和LIF蛋白表達(dá)水平降低的主要原因之一，可能是胚胎植入期暴露于CS2致胚胎植入障礙的重要機(jī)制;胚胎植入期GD4暴露是CS2致子宮組織中整合素ανβ3和LIFmRNA表達(dá)水平改變的敏感期。
　　 2.植入期CS2暴露并沒有明顯改變?cè)惺笞訉m組織整合素ανβ3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。提示整合素ανβ3mRNA表達(dá)水平的降低與其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況無明顯關(guān)聯(lián)。LIF基因啟動(dòng)子區(qū)無