酸性肽長(zhǎng)期毒性及致癌性研究.pdf

1、背景和目的：自從1931年P(guān)物質(zhì)被分離以來(lái)，已有眾多的內(nèi)源性神經(jīng)肽被分離和研究。它們?cè)谏窠?jīng)調(diào)節(jié)中有多種多樣的生物學(xué)功能，神經(jīng)肽作為新的藥物來(lái)源，正在受到人們廣泛重視。 本課題組從牛腦中分離出了一種新的酸性肽(acidpeptieAP)。它由3個(gè)谷氨酸構(gòu)成。研究表明這種酸性肽具有明顯的生物學(xué)活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸性肽對(duì)癡呆小鼠和阿爾茨海默病(AD)模型大鼠有良好的治療作用。酸性肽能提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(S∞)

2、活性升高和抑制丙二醛(MDA)的生成，酸性肽對(duì)AD模型大鼠能夠顯著降低其腦中一氧化氮(N0)和一氧化氮合酶(№S)的含量，減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，有助于受損大腦的康復(fù)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，酸性肽有抗突變作用。急性毒性實(shí)驗(yàn)證明該藥品安全范圍大，無(wú)急性毒性反應(yīng)，口服耐受劑量大于5g／kg。 為進(jìn)一步觀(guān)察酸性肽長(zhǎng)期用藥后有無(wú)毒性，尋找可能的靶器官及停藥后組織和功能損害，為臨床安全用藥進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，故對(duì)酸性肽的長(zhǎng)期毒性和致癌性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

3、 方法： 一、酸性肽大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)國(guó)家新藥研制指導(dǎo)原則的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)方法和先前急性毒性實(shí)驗(yàn)的口服給藥劑量大干5g/kg仍未產(chǎn)生毒性反應(yīng)和死亡的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用高出臨床擬用劑量50倍的劑量組，進(jìn)行“限度實(shí)驗(yàn)”。大鼠分兩個(gè)組：限度實(shí)驗(yàn)組以1．5g／kg酸性肽溶液灌胃：正常對(duì)照組以同樣體積的蒸餾水灌胃。 給藥周期為3個(gè)月，每周7天連續(xù)給藥。給藥期間的一般觀(guān)察內(nèi)容主要包括外觀(guān)體征和行為活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)異常如神態(tài)萎靡、

4、蜷縮不動(dòng)或過(guò)度興奮、躁動(dòng)驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常、皮毛貼身或稀疏等，及時(shí)處理與記錄。 觀(guān)測(cè)指標(biāo)包括血液檢查和病理檢查：血液檢查分為：1、血液學(xué)指標(biāo)：包括紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間，2、血液生化指標(biāo)：包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST或SGOT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT或SGPT)、堿性磷酸酶(ALP或AKP)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、自蛋白(ALB)、血糖(GLU)、’總

5、膽紅素(TBIL)、肌酐(cR)、總膽固醇(TCHO)；病理檢查包括大體檢查和顯微鏡檢查。大體檢查要進(jìn)行尸體解剖，解剖后取出心、肝、脾、肺、。腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸、子宮、腦和前列腺稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)。組織切片染色后在顯微鏡下檢查． 二、酸性肽小鼠肺腫瘤誘發(fā)實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)高、中、低劑量的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組雌雄小鼠各40只。低劑量組給藥O．4g／kg／同。中劑量組給藥4g／kg／同。高劑量組給藥40g/k

6、g／同。對(duì)照組只給飲用水。給藥周期為32周，每周7天連續(xù)給藥。 觀(guān)測(cè)指標(biāo)包括一般觀(guān)察和病理檢查：一般觀(guān)察內(nèi)容主要包括外觀(guān)體征和行為活動(dòng)；病理檢查包括尸體解剖和顯微鏡檢查。尸體解剖須細(xì)致檢查各組織和器官如心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胰腺、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、前列腺、淋巴結(jié)、膀胱、甲狀腺、胸腺、睪丸(連附睪)、子宮(及卵巢)等，若見(jiàn)腫塊應(yīng)記錄發(fā)生部位、大小、質(zhì)地、有無(wú)包膜、色澤，是否屬該動(dòng)物品系自發(fā)性腫瘤、發(fā)生例數(shù)等。顯微

7、鏡檢查對(duì)象是各組小鼠的肺臟和各部位發(fā)現(xiàn)的腫塊。 結(jié)果： 一、酸性肽大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)： L大鼠的外觀(guān)特征：兩組大鼠都是毛色白而光澤、耳色紅潤(rùn)、活動(dòng)自如、反應(yīng)性好、飲食正常、尿糞正常、飲水進(jìn)食及發(fā)育情況良好：沒(méi)有異常消瘦、體重增加的大鼠；處死前沒(méi)有大鼠死亡。 2．將兩組大鼠的各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比處理發(fā)現(xiàn)：兩組大鼠的各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)沒(méi)有有統(tǒng)計(jì)意義的差別(P紅細(xì)胞>O．05；P血紅蛋白>0．05；P激血時(shí)間

8、>0．05；P白細(xì)胞>0．05；P嗜中性細(xì)胞>0．05；P嗜酸性細(xì)胞>0．05；P嗜堿性細(xì)胞>0．05；P淋巴細(xì)胞>0．05；P單核細(xì)胞>0．05；P血小板>0．05)。 3．將兩組大鼠的各項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比處理發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的各項(xiàng)生化指標(biāo)之間沒(méi)有有統(tǒng)計(jì)意義的差別(P呲釉酶>0．05；P尿素氮>O．05；P肌酐>O．05：P糖>O．05；P膽固醇>0．05；P膽紅素>0．05；P谷丙轉(zhuǎn)氨酶>O．05；P谷革轉(zhuǎn)氨酶

9、>O．05；P總蛋白>0．05；P白蛋白>0．05)。 4．對(duì)兩組大鼠的臟器系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比處理發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的各項(xiàng)臟器系數(shù)之間沒(méi)有有統(tǒng)計(jì)意義的差別(P心臟>0．05；P甲狀腺>O．05；P肝臟>0．05；P脾臟>O．05；P肺臟>0．05；P腎臟>O．05；P腎上腺>0。05；P腦>O．05；P睪丸>O。05；P前列腺>0．05)。 5．顯微鏡檢查：各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠心臟、甲狀腺、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、

10、腎上腺、腦、睪丸、前列腺、子宮、卵巢、胰腺、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、垂體、脊髓、淋巴結(jié)、膀胱、胸腺、睪丸、附睪、視神經(jīng)等主要臟器大體及鏡下檢查均未見(jiàn)明顯病理變化。 二、酸性肽小鼠肺腫瘤誘發(fā)實(shí)驗(yàn)： 1．一般觀(guān)察：給藥過(guò)程中多數(shù)小鼠表現(xiàn)正常，進(jìn)食、飲水正常、尿糞正常、毛色順白而有光澤、活動(dòng)自如、反應(yīng)性好、生長(zhǎng)發(fā)育良好。個(gè)別小鼠相互撕咬，有的小鼠受傷了，這種撕咬僅僅出現(xiàn)在各組雄鼠，各組雌鼠無(wú)咬傷現(xiàn)象，這可能與雄鼠好斗的生活習(xí)

11、性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)期間4例死亡，解剖說(shuō)明小鼠均是死于炎癥或感染，死亡小鼠的分布一個(gè)在高劑量組，一個(gè)在中劑量組，兩個(gè)在對(duì)照組。小鼠的死亡和實(shí)驗(yàn)藥物沒(méi)有關(guān)系。 2．大體解剖情況：小鼠處死后進(jìn)行了解剖，仔細(xì)觀(guān)察心、肝、肺、腎、腦、淋巴結(jié)、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、睪丸(連附睪)、子宮(及卵巢)等主要內(nèi)臟器官。肉眼可見(jiàn)多數(shù)小鼠各臟器正常。摘除臟器后觀(guān)察胸腔、腹腔可見(jiàn)其內(nèi)液體清亮、量少，無(wú)膿性、或顏色異常的積液。共在33只小鼠身上發(fā)現(xiàn)266個(gè)包

12、塊，這些包塊集中分布在肺、肝、皮下3處。這些腫塊的組別分布是：高劑量實(shí)驗(yàn)組雄鼠4只，雌鼠3只，共7只；中劑量實(shí)驗(yàn)組雄鼠3只，雌鼠4只，共7只；低劑量實(shí)驗(yàn)組雄鼠5只，雌鼠5只，共10只；對(duì)照組雄鼠5只，雌鼠4只，共9只。統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比處理發(fā)現(xiàn)，包塊出現(xiàn)的頻率在各組之間沒(méi)有差別(P＞0．05)，它的出現(xiàn)頻率和給藥劑量高低也沒(méi)有關(guān)系。 3．顯微鏡檢查：對(duì)每個(gè)小鼠的肺和尸體解剖中發(fā)現(xiàn)的腫塊進(jìn)行了病理切片檢查。顯微鏡檢查證實(shí)，在以上所檢出的腫

13、塊中，只有3個(gè)皮下腫塊是腫瘤，肝、肺所見(jiàn)腫塊是壞死組織。3個(gè)皮下腫塊確診為腺樣囊性癌。發(fā)生皮下腫瘤的小鼠中劑量實(shí)驗(yàn)組雌鼠、低劑量實(shí)驗(yàn)組雌鼠、對(duì)照組雌鼠各1只，統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間、各組和全體之間腫瘤發(fā)生率沒(méi)有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P>0．05)。小鼠所發(fā)生的這幾個(gè)皮下腫瘤，和給藥與否、給藥劑量沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。 結(jié)論： 1．酸性肽的長(zhǎng)期應(yīng)用并沒(méi)有對(duì)大鼠造成可以檢查出來(lái)的毒性影響。 2．在32周的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)