葡萄WRKYs響應(yīng)葡萄根瘤蚜侵害的分子機(jī)理.pdf

1、葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliaeFitch）專性寄生于葡萄根系和葉片，歷史上曾對歐洲葡萄造成了毀滅性為害。目前生產(chǎn)上主要通過使用抗性砧木嫁接防治根瘤蚜，但我們對葡萄砧木抗根瘤蚜侵害的分子機(jī)理還知之甚少。植物 WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物界數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，本論文以敏感品種克瑞森和抗性砧木1103Paulsen為試材，探究了葡萄WRKYs對根瘤蚜侵害的應(yīng)答反應(yīng)，主要研究結(jié)果如下。
　　1、葡萄（Vi

2、tis viniferaL.）中共發(fā)現(xiàn)63個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的分類原則,除VvWRKY32-2外其它共分成3大類和7個(gè)亞類，63個(gè)葡萄WRKY基因不均勻地分布在除第3號染色體外的其它18條染色體和一條未知染色體上，亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件分析表明絕大多數(shù)葡萄 WRKY定位于細(xì)胞核。外顯子及蛋白長度分析表明序列缺失參與WRKY進(jìn)化，而基因組復(fù)制促進(jìn)了WRKY家族成員擴(kuò)增。在發(fā)育的葡萄果實(shí)各組織（果皮、果肉和種子）

3、中，葡萄WRKY基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)豐度，還有一些基因表達(dá)存在明顯的時(shí)空特異性。
　　2、WRKY基因響應(yīng)葡萄-根瘤蚜之間的互作反應(yīng)。根瘤蚜侵染導(dǎo)致敏感品種克瑞森30多個(gè)WRKY基因的表達(dá)量發(fā)生變化，多數(shù)基因的表達(dá)量上調(diào)，僅VvWRKY20、24、42、49和51-2表達(dá)量顯著下調(diào)。抗性砧木1103 Paulsen（V.Berlandieri×V.Rupetris）WRKY基因表達(dá)量變化與克瑞森基本一致，但VvWRKY2-2和Vv

4、WRKY42在1103Paulsen中的表達(dá)模式與克瑞森相反，這可能是決定不同基因型葡萄對根瘤蚜抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。根結(jié)形成時(shí)部分 WRKY基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，與未侵染的對照相比根結(jié)中VvWRKY2和VvWRKY46表達(dá)量下調(diào)，而VvWRKY51-1、VvWRKY53和VvWRKY55表達(dá)量升高，表明 WRKY基因正/負(fù)調(diào)節(jié)葡萄對根瘤蚜的防御反應(yīng)。另外，WRKY基因在靠近根結(jié)未被侵害的根中也表現(xiàn)出與根結(jié)中類似的表達(dá)模式，說明根瘤蚜

5、對葡萄WRKY基因的誘導(dǎo)是系統(tǒng)性的。
　　3、我們同時(shí)檢測了部分WRKY基因在敏感、中抗和免疫葡萄根系和葉片中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄根系和葉片中WRKY基因組成型表達(dá)量與其根瘤蚜抗性強(qiáng)弱無相關(guān)性，根瘤蚜侵害能夠啟動(dòng)葡萄WRKY基因介導(dǎo)的誘導(dǎo)型防御反應(yīng)。
　　4、葡萄SA信號途徑相關(guān)基因參與葡萄-根瘤蚜互作反應(yīng)。根瘤蚜瞬時(shí)侵害抑制SA積累相關(guān)基因如VvPAD4和VvMATE的表達(dá)，使根系和葉片中總SA含量分別下降24％和58

6、%，但同時(shí)誘導(dǎo)1103Paulsen根系中 PRs基因表達(dá)量上調(diào)，如VvG1、VvCHI1B、VvCHI1B1和PR3。施用外源SA和Me-JA分別降低根瘤蚜若蟲成活率50%和24%。推測PRs基因的上調(diào)與總SA的下降無關(guān)，是受到其它因子的調(diào)控。另外，VvCHI1B在1103P形成的根結(jié)中表達(dá)量上調(diào)了50倍，而在克瑞森的根結(jié)中表達(dá)量下調(diào)。
　　5、擬南芥同源基因功能分析推測VvWRKY40-1和VvWRKY46參與葡萄SA信號途徑

7、，且與克瑞森相比這兩個(gè)基因在1103Paulsen中持續(xù)響應(yīng)根瘤蚜侵害。Race結(jié)果表明VvWRKY40-1和VvWRKY46的開放閱讀框長度分別是954bp和1050bp，其編碼的蛋白都定位于細(xì)胞核。瞬時(shí)表達(dá)和體外試驗(yàn)證明 VvWRKY40-1和 VvWRKY46蛋白能夠與順式作用元件Wbox(T)(T)TGAC(C/T)結(jié)合互作，啟動(dòng)下游基因表達(dá)。酵母單雜交和同源共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白分別與VvCH