心臟營養(yǎng)素-1（Cardiotrophin-1）延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用和機制研究.pdf

1、目的：(1)探討心臟營養(yǎng)素一1(Cardiotrophin．1，CT-1)及其受體亞基gpl30，LIFR-β(白血病抑制因子受體一D)在失神經(jīng)骨骼肌中的表達規(guī)律，為應(yīng)用CT-1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮提供理論依據(jù)。(2)觀察外源性CT一1對失神經(jīng)骨骼肌的營養(yǎng)和保護作用。(3)觀察經(jīng)CT-1治療后的失神經(jīng)骨骼肌在重獲神經(jīng)支配后的功能恢復(fù)情況。(4)初步探討CT-1延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用機制。(5)觀察應(yīng)用不同劑量的外源性CT-!對其他組

2、織和器官的作用，探討CT-1的副作用，并明確應(yīng)用CT一1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的有效劑量和安全劑量，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)選用11組Swiss小鼠，每組10只，切斷其右側(cè)脛神經(jīng)，分別于0，6，12h和1，3，5，7，10，14，21，28d完整切取右側(cè)腓腸肌，用Northernblot法測定失神經(jīng)腓腸肌中CT-1和LIFR．β，gpl30的mRNA含量，探討3者的表達規(guī)律。(2)另取Swiss小鼠30只，同樣方法切斷其

3、脛神經(jīng)后，連續(xù)腹腔注射CT-1(100[tg／kg/d)，于7、14和28d后檢測失神經(jīng)腓腸肌的濕重、肌纖維橫截面積和肌肉總蛋白含量、超微結(jié)構(gòu)以及肌張力的變化，分別與對照組比較，觀察CT-1能否減輕失神經(jīng)腓腸肌萎縮的程度。(3)將脛神經(jīng)切斷后的60只小鼠，隨機分成6組，每組10只，其中3組每日腹腔注射rmCT-1(100μg／kg/d)，另外3組作為對照，每日腹腔注射等量CT一1溶媒。一個月后，停止給藥，再次手術(shù)，行脛神經(jīng)的修復(fù)。分別于

4、神經(jīng)修復(fù)后4、8和12w檢測重獲神經(jīng)支配的腓腸肌復(fù)合肌肉動作電位、肌張力、濕重和總蛋白含量，以及再生脛神經(jīng)有髓纖維計數(shù)和坐骨神經(jīng)誘發(fā)電位潛伏期的變化。觀察經(jīng)CT一1治療后的失神經(jīng)腓腸肌在重獲神經(jīng)支配后的功能恢復(fù)情況。(4)從失神經(jīng)骨骼肌細胞凋亡、蛋白代謝、興奮一收縮耦聯(lián)、肌衛(wèi)星細胞狀態(tài)等方面對CT-1延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的機制進行探討。用TUNEL法檢測小鼠失神經(jīng)腓腸肌細胞的凋亡率，用Northemblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Fas和Bc

5、l-2的表達變化，觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌細胞凋亡的影響；用Northemblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后收縮蛋白中a-actin和MHCIIa的變化，用Westernblot法檢測失神經(jīng)腓腸肌中保護性蛋白HSP70和HSP90的含量，觀察CT一1對失神經(jīng)骨骼肌收縮蛋白和保護性蛋白合成的影響：用Northernblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后蛋白水解途徑中泛素和調(diào)節(jié)復(fù)合物RC2的表達，用HPLC法檢測失神經(jīng)腓腸肌中MeHis的釋放量，

6、觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌蛋白水解過程的影響；用Westernblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后肌漿網(wǎng)Ca2*-APTase的含量，觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌收縮功能的影響；用電鏡檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)學(xué)變化，觀察CT一1對失神經(jīng)骨骼肌肌衛(wèi)星細胞活躍程度的影響。(5)取Swiss小鼠80只，隨機分成8組，分別于脛神經(jīng)切斷術(shù)后連續(xù)腹腔注射rmCT-140、60、80、100、120、140、160~g/kg／d，剩余一組作為

7、對照，腹腔注射等體積CT一1溶媒，28天后稱量失神經(jīng)側(cè)腓腸肌、正常側(cè)腓腸肌和心臟的濕重；測量胸主動脈平滑肌厚度；用Northernblot法檢測正常腓腸肌中α—actin和MHCI工a以及心肌中β—MHC的表達；用Westernblot法檢測胸主動脈血管平滑肌細胞中α一actin的含量，探討應(yīng)用CT-1防治失神經(jīng)骨骼肌萎縮時，可能對正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌產(chǎn)生的副作用，以及應(yīng)用CT-1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的有效劑量和安全劑量。

8、 結(jié)果：(1)CT-1及其受體gpl30／LIFR-β在正常骨骼肌中均有表達。脛神經(jīng)切斷后，腓腸肌中CT-1的表達進行性下降；而LIFR-β和gpl30在早期均有一個表達增高的過程，前者的表達高峰出現(xiàn)在失神經(jīng)支配后24小時，后者在神經(jīng)切斷后1周表達最高。(2)連續(xù)應(yīng)用外源性CT一11周時，即改善了失神經(jīng)骨骼肌的肌張力，減輕了肌漿網(wǎng)的擴張程度，用藥2周時，有效地維持了失神經(jīng)腓腸肌的濕重、肌纖維橫截面積和總蛋白含量。用藥4周后，這種效果更

9、加明顯。(3)在對再生神經(jīng)軸突數(shù)量和功能的檢測中發(fā)現(xiàn)，CT-1注射組和溶媒注射組的神經(jīng)軸突的數(shù)量和再生神經(jīng)潛伏期均無明顯差異。但經(jīng)CT-1治療后，神經(jīng)再支配腓腸肌的濕重、肌纖維截面積、肌肉總蛋白含、CMAP波幅和肌張力均有明顯改善。(4)外源性CT-1的應(yīng)用抑制了失神經(jīng)骨骼肌細胞FasmRNA的表達、促進了Bcl一2mRNA的表達、降低了失神經(jīng)骨骼肌細胞的凋亡率：促進了骨骼肌細胞收縮蛋白的a-actin、MHCIIamRNA的表達，和保

10、護性蛋白HSP70、HSP90的合成；提高了失神經(jīng)骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的含量。但對失神經(jīng)骨骼肌蛋白水解途徑中泛素和調(diào)節(jié)復(fù)合物RC2mRNA的表達、失神經(jīng)骨骼肌中MeHis的釋放量、以及神經(jīng)骨骼肌肌衛(wèi)星細胞的活躍程度均無無明顯影響。(5)采用腹腔注射這種給藥途徑來治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮時，當CT—l用量達到60pg/kg／d時，即可對失神經(jīng)骨骼肌產(chǎn)生營養(yǎng)作用，隨著給藥劑量的增加，CT—l對失神經(jīng)骨骼肌的營養(yǎng)作用也在不斷增強，但

11、當給藥劑量超過100~tg／kg／d后，CT一1的營養(yǎng)作用雖然還在增加，但已經(jīng)逐漸開始出現(xiàn)導(dǎo)致正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌的副作用，當給藥劑量達到1201xg／kg／d時，開始促進心肌p—MHCmRNA的表達，增加正常心臟的濕重。當給藥劑量達到140pg／kg／d時，開始促進正常骨骼肌a-actin和MHCIIamRNA的表達，以及骨骼肌濕重的增加，同時提高了主動脈血管平滑肌a-actin的含量，增加了血管平滑肌的厚度。 結(jié)論：

12、骨骼肌失神經(jīng)后內(nèi)源性CT一1表達不足，是導(dǎo)致失神經(jīng)骨骼肌早期萎縮的一個重要因素。而受體gpl30／LIFR-p的表達上調(diào)，提高了肌肉對其配體CT一1的敏感性，及時應(yīng)用外源性CT一1，可通過促進骨骼肌收縮性蛋白和保護性蛋白的合成、提高肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的含量、抑制骨骼肌細胞的凋亡等途徑對失神經(jīng)骨骼肌產(chǎn)生營養(yǎng)和保護作用，有效地延緩失神經(jīng)骨骼肌的萎縮，并改善神經(jīng)再支配骨骼肌的功能，是一種很有前景的肌營養(yǎng)因子。在通過腹腔注射防治失神經(jīng)