心臟營養(yǎng)素-1(Cardiotrophin-1)延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用和機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:(1)探討心臟營養(yǎng)素一1(Cardiotrophin.1,CT-1)及其受體亞基gpl30,LIFR-β(白血病抑制因子受體一D)在失神經(jīng)骨骼肌中的表達規(guī)律,為應用CT-1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮提供理論依據(jù)。(2)觀察外源性CT一1對失神經(jīng)骨骼肌的營養(yǎng)和保護作用。(3)觀察經(jīng)CT-1治療后的失神經(jīng)骨骼肌在重獲神經(jīng)支配后的功能恢復情況。(4)初步探討CT-1延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用機制。(5)觀察應用不同劑量的外源性CT-!對其他組

2、織和器官的作用,探討CT-1的副作用,并明確應用CT一1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的有效劑量和安全劑量,為臨床應用奠定基礎。 方法:(1)選用11組Swiss小鼠,每組10只,切斷其右側脛神經(jīng),分別于0,6,12h和1,3,5,7,10,14,21,28d完整切取右側腓腸肌,用Northernblot法測定失神經(jīng)腓腸肌中CT-1和LIFR.β,gpl30的mRNA含量,探討3者的表達規(guī)律。(2)另取Swiss小鼠30只,同樣方法切斷其

3、脛神經(jīng)后,連續(xù)腹腔注射CT-1(100[tg/kg/d),于7、14和28d后檢測失神經(jīng)腓腸肌的濕重、肌纖維橫截面積和肌肉總蛋白含量、超微結構以及肌張力的變化,分別與對照組比較,觀察CT-1能否減輕失神經(jīng)腓腸肌萎縮的程度。(3)將脛神經(jīng)切斷后的60只小鼠,隨機分成6組,每組10只,其中3組每日腹腔注射rmCT-1(100μg/kg/d),另外3組作為對照,每日腹腔注射等量CT一1溶媒。一個月后,停止給藥,再次手術,行脛神經(jīng)的修復。分別于

4、神經(jīng)修復后4、8和12w檢測重獲神經(jīng)支配的腓腸肌復合肌肉動作電位、肌張力、濕重和總蛋白含量,以及再生脛神經(jīng)有髓纖維計數(shù)和坐骨神經(jīng)誘發(fā)電位潛伏期的變化。觀察經(jīng)CT一1治療后的失神經(jīng)腓腸肌在重獲神經(jīng)支配后的功能恢復情況。(4)從失神經(jīng)骨骼肌細胞凋亡、蛋白代謝、興奮一收縮耦聯(lián)、肌衛(wèi)星細胞狀態(tài)等方面對CT-1延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的機制進行探討。用TUNEL法檢測小鼠失神經(jīng)腓腸肌細胞的凋亡率,用Northemblot法檢測凋亡相關蛋白Fas和Bc

5、l-2的表達變化,觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌細胞凋亡的影響;用Northemblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后收縮蛋白中a-actin和MHCIIa的變化,用Westernblot法檢測失神經(jīng)腓腸肌中保護性蛋白HSP70和HSP90的含量,觀察CT一1對失神經(jīng)骨骼肌收縮蛋白和保護性蛋白合成的影響:用Northernblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后蛋白水解途徑中泛素和調節(jié)復合物RC2的表達,用HPLC法檢測失神經(jīng)腓腸肌中MeHis的釋放量,

6、觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌蛋白水解過程的影響;用Westernblot法檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后肌漿網(wǎng)Ca2*-APTase的含量,觀察CT-1對失神經(jīng)骨骼肌收縮功能的影響;用電鏡檢測小鼠腓腸肌失神經(jīng)后肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)學變化,觀察CT一1對失神經(jīng)骨骼肌肌衛(wèi)星細胞活躍程度的影響。(5)取Swiss小鼠80只,隨機分成8組,分別于脛神經(jīng)切斷術后連續(xù)腹腔注射rmCT-140、60、80、100、120、140、160~g/kg/d,剩余一組作為

7、對照,腹腔注射等體積CT一1溶媒,28天后稱量失神經(jīng)側腓腸肌、正常側腓腸肌和心臟的濕重;測量胸主動脈平滑肌厚度;用Northernblot法檢測正常腓腸肌中α—actin和MHCI工a以及心肌中β—MHC的表達;用Westernblot法檢測胸主動脈血管平滑肌細胞中α一actin的含量,探討應用CT-1防治失神經(jīng)骨骼肌萎縮時,可能對正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌產生的副作用,以及應用CT-1治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的有效劑量和安全劑量。

8、 結果:(1)CT-1及其受體gpl30/LIFR-β在正常骨骼肌中均有表達。脛神經(jīng)切斷后,腓腸肌中CT-1的表達進行性下降;而LIFR-β和gpl30在早期均有一個表達增高的過程,前者的表達高峰出現(xiàn)在失神經(jīng)支配后24小時,后者在神經(jīng)切斷后1周表達最高。(2)連續(xù)應用外源性CT一11周時,即改善了失神經(jīng)骨骼肌的肌張力,減輕了肌漿網(wǎng)的擴張程度,用藥2周時,有效地維持了失神經(jīng)腓腸肌的濕重、肌纖維橫截面積和總蛋白含量。用藥4周后,這種效果更

9、加明顯。(3)在對再生神經(jīng)軸突數(shù)量和功能的檢測中發(fā)現(xiàn),CT-1注射組和溶媒注射組的神經(jīng)軸突的數(shù)量和再生神經(jīng)潛伏期均無明顯差異。但經(jīng)CT-1治療后,神經(jīng)再支配腓腸肌的濕重、肌纖維截面積、肌肉總蛋白含、CMAP波幅和肌張力均有明顯改善。(4)外源性CT-1的應用抑制了失神經(jīng)骨骼肌細胞FasmRNA的表達、促進了Bcl一2mRNA的表達、降低了失神經(jīng)骨骼肌細胞的凋亡率:促進了骨骼肌細胞收縮蛋白的a-actin、MHCIIamRNA的表達,和保

10、護性蛋白HSP70、HSP90的合成;提高了失神經(jīng)骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的含量。但對失神經(jīng)骨骼肌蛋白水解途徑中泛素和調節(jié)復合物RC2mRNA的表達、失神經(jīng)骨骼肌中MeHis的釋放量、以及神經(jīng)骨骼肌肌衛(wèi)星細胞的活躍程度均無無明顯影響。(5)采用腹腔注射這種給藥途徑來治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮時,當CT—l用量達到60pg/kg/d時,即可對失神經(jīng)骨骼肌產生營養(yǎng)作用,隨著給藥劑量的增加,CT—l對失神經(jīng)骨骼肌的營養(yǎng)作用也在不斷增強,但

11、當給藥劑量超過100~tg/kg/d后,CT一1的營養(yǎng)作用雖然還在增加,但已經(jīng)逐漸開始出現(xiàn)導致正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌的副作用,當給藥劑量達到1201xg/kg/d時,開始促進心肌p—MHCmRNA的表達,增加正常心臟的濕重。當給藥劑量達到140pg/kg/d時,開始促進正常骨骼肌a-actin和MHCIIamRNA的表達,以及骨骼肌濕重的增加,同時提高了主動脈血管平滑肌a-actin的含量,增加了血管平滑肌的厚度。 結論:

12、骨骼肌失神經(jīng)后內源性CT一1表達不足,是導致失神經(jīng)骨骼肌早期萎縮的一個重要因素。而受體gpl30/LIFR-p的表達上調,提高了肌肉對其配體CT一1的敏感性,及時應用外源性CT一1,可通過促進骨骼肌收縮性蛋白和保護性蛋白的合成、提高肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的含量、抑制骨骼肌細胞的凋亡等途徑對失神經(jīng)骨骼肌產生營養(yǎng)和保護作用,有效地延緩失神經(jīng)骨骼肌的萎縮,并改善神經(jīng)再支配骨骼肌的功能,是一種很有前景的肌營養(yǎng)因子。在通過腹腔注射防治失神經(jīng)

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