RNA干擾介導泛素連接酶MuRF1和叉頭蛋白轉錄因子FOXO3a基因下調延緩失神經骨骼肌萎縮的體外研究.pdf

1、目的
　　探討RNAi技術體外抑制MuRF1或FOXO3a基因表達的效果，為RNAi介導的失神經骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎。
　　方法
　　訂購MuRF-1和FOXO3a兩基因的siRNA重組質粒，培養(yǎng)大鼠成肌細胞系L6，將MuRF1和（或）FOXO3asiRNA重組質粒在Lipofectamine2000介導下轉染，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，于轉染后48h與72h，采用實時定量PCR和Westernblot檢

2、測siRNA重組質粒對MuRF1和FOXO3a的mRNA和蛋白質水平的抑制效果。
　　結果
　　1.轉染后24h，熒光倒置顯微鏡下觀察到細胞中有綠色熒光表達，表明成功將質粒轉染到大鼠成肌細胞系L6中。
　　2.實時定量PCR分析結果顯示：MuRF1與FOXO3a各自的siRNA重組質粒轉染后48h，二者干擾序列在mRNA水平分別明顯抑制了MuRF1和FOXO3a的表達，抑制率達67％和54％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意

3、義（P<0.05）,聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質粒轉染后48h，干擾序列在mRNA水平亦明顯抑制了MuRF1及FOXO3a的表達，抑制率達61％及58％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；轉染后72h，MuRF1與FOXO3a各自的siRNA重組質粒干擾序列對MuRF1和FOXO3a的mRNA的抑制率分別達79％和81％，聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質粒干擾序列對MuRF1和FOXO

4、3a的mRNA的抑制率達77％及72％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），抑制效應與48h相比更為明顯。但單獨轉染組與聯(lián)合轉染組之間抑制效應差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.Western印跡灰度分析結果顯示：轉染后48h，干擾序列MuRF1明顯抑制了MuRF1蛋白的表達，抑制率達61％，干擾序列FOXO3a明顯抑制了FOXO3a蛋白的表達，抑制率達46％，二者與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,

5、聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質粒干擾序列對MuRF1和FOXO3a蛋白表達的抑制率達64％及42％，與對照組相比差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；轉染后72h，干擾序列MuRF1對MuRF1蛋白表達的抑制率達70％，干擾序列FOXO3a對FOXO3a蛋白表達的抑制率達72％，同樣二者與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質粒干擾序列對MuRF1和FOXO3a

6、蛋白表達的抑制率達73％及74％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,抑制效應較轉染后48h更為明顯。但單獨轉染組與聯(lián)合轉染組之間抑制效應差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這與干擾序列對mRNA表達水平的影響一致。
　　結論
　　1.RNA干擾技術在體外能夠明顯抑制泛素連接酶MuRF1和叉頭蛋白轉錄因子FOXO3a基因的表達。
　　2.體外研究中MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質粒聯(lián)合轉染與各基因